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(無題) 削除/引用 No.6149-7 - 2017/07/29 (土) 03:54:19 - おお 特異的なバンドがゲルから切り出されるならいいでしょう。非特異が出ていいかどうかは実験系次第です。

非特異的な増幅ととシーケンス 削除/引用 No.6149-6 - 2017/07/28 (金) 13:00:00 - シーケンス みなさま　ありがとうございます 返信遅くなりました 追加の質問なのですが， 配列解析用のPCRについてなんですけど， ゲル抽出するときは 非特異的な増幅についてはそこまで気にしなくていいでしょうか？ （最終的に配列が読めればいいという考えてやっています） プライマー設計のサイトとかを読むと 特異的な増幅にこだわっているのですが（あることに越したことはない）， そういうのはRT-PCRやqPCRを行う用のプライマーを意図しているからでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.6149-5 - 2017/07/24 (月) 14:31:36 - おお >その周辺の配列決定を効率的に行う方法はありますか？ 5' RACE, 3' RACEという方法があります。ググったりして調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.6149-4 - 2017/07/24 (月) 14:23:25 - AP 塩基配列の保存性のみならず、アミノ酸配列の保存性も見たほうがいいかも。 同義コドンは1,2番目の塩基が変わらず、3塩基目がばらついているものなので、確実に一致していることが要求されるプライマーの3'末端はコドンの３位目を避ける。 また、アミノ酸が保存されていているけれどコドンが派生している可能性がある配列が内包されている場合、コドンの３位目をイノシンにしておく方法もポピュラーです。イノシンは一種のワイルドカード的な塩基になります。 >シークエンスのときに，相補鎖も見るべきですか？ 読み取り精度も上がり、遺伝子情報のデータも激増した現在では必要ないでしょう。片側鎖を読んでみてどうしても解読できない、疑義がある、という場合だけ相補鎖も読むというので十分です。 今なら、生物界にどんな遺伝子があってどんなタンパク質があるかの情報が蓄積されていて手本や参考になる配列が揃っていますから、致命的なシークエンスの読み違いがあればなにかしらデーターベースの情報との食い違いが出るはずです。

(無題) 削除/引用 No.6149-3 - 2017/07/24 (月) 13:30:36 - おお �A保存性が高い配列調べる際に，他種やアイソマーは 可能なだけアライメントをかけたほうがいいのか？ まあ調べたほうがいいでしょう。種間でなるべく保存されているところ（アミノ酸レベルとかで）を探すことになると思います。

(無題) 削除/引用 No.6149-2 - 2017/07/24 (月) 13:28:04 - おお >この手法に名前とかってありますか？ degenerate PCR http://www.bloodjournal.org/content/92/9/3189?sso-checked=true �Cと多分関係あると思うのですが、こういったPCRは まずよく保存されたドメイン、コンセンサス配列をよく狙います。それで配列を読んでから、全長を探ることになるかと。ただ保存された部分を使うので、その生物じしん遺伝子のファミリーとして複数持っていて、狙ったもの以外にも増幅されるとか、狙ったもの以外が増幅されるとかあるかもしれません。

他種の塩基配列決定用のプライマー設計と戦略 削除/引用 No.6149-1 - 2017/07/24 (月) 11:27:38 - シーケンス ダイレクトシークエンスにて，ある魚の未知の遺伝子配列決定しようとしています。 既知配列の確認用のプライマーを設計したことはありますが，未知配列は初めてです。 他種で保存性が高い配列を基にプライマー設計(20bp程度)しようとしています。 �@数塩基の塩基保存性が低い時，Nなどで補足する設計は問題ないですか？ ちなみに，この手法に名前とかってありますか？ �A保存性が高い配列調べる際に，他種やアイソマーは 可能なだけアライメントをかけたほうがいいのか？ （しっかり時間をとった方が良いのか） �Bシークエンスのときに，相補鎖も見るべきですか？ �CデータベースのcDNA配列の登録データをみたときに開始コドンからの ものが割と多いのですが，保存性の高いプライマーがつくりにくく困っていますが その周辺の配列決定を効率的に行う方法はありますか？

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