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(無題) 削除/引用 No.6448-9 - 2017/11/10 (金) 15:36:19 - おお >（〜５０mMとか） （~５０mMとか） >１００〜１５０mM NaCl １００~１５０mM NaCl

(無題) 削除/引用 No.6448-8 - 2017/11/10 (金) 15:34:22 - おお KPB bufferの組成ありがとうございました。５mMのリン酸バッファーということになりますね。初っ端の細胞などを破砕するバッファーにしては濃度が低いような気がします。通常は十分なバッファー効果が得られるように濃い目にすることがおおいです（〜５０mMとか）。まあ、LysatesのpHをpH試験紙で確認してpHが大きくそれてないようなら５mMでもいいかもしれませんけど。 前にコメントしたように、イオン強度が低いと溶出してこない蛋白は結構あると思います。生理的に近い塩濃度のほうが、より生体の条件に近いだろうと言うことも手伝い、あまり何も考えず生理的な塩濃度でバッファーで抽出することもおおいとおもいます。だいたい１００〜１５０mM NaCl。培養などで使っているPBSなんかがあればそれをそのまま使っている人もいるでしょう。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.6448-7 - 2017/11/10 (金) 11:05:11 - あ おお様 ご返信ありがとうございます。 bufferについてですが0.5 M KH2PO4/0.5 M K2HPO4のリン酸緩衝液を100倍希釈で使用しています。 目的のタンパク質は酵素であるため失活の確認はシンプルに酵素活性の測定により行うことにします。 私の研究テーマとしては目的タンパク質の高発現系の確立ではなく特性評価なので少しでも可溶画分で確認できるようであればそのまま精製、濃縮の操作に進みたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.6448-6 - 2017/11/09 (木) 17:27:05 - おお 10 mM KPB bufferの塩濃度はどれくらいですか？Inclusion bodyを形成してなくてもイオン強度やpHによっては抽出しづらいタンパク質もあります。３００ー５００mMのNaClとかで抽出される可能性もあると思います。また場合によっては結構高濃度のDTTを使う人もいるかと。 比較的マイルドなChaotropic作用を持つものも使える可能性がありますLiCl （３００mMー５M）、LiSCN （３００mMー９M）、MgCl2 （３Mー）。また強力なChaotropic作用を持つUreaを低濃度で（１ー２M）使うこともあるようです。 デタージェントは使えないと考えてますか？ いずれもInclusion bodyをつくっていたら完全に溶出できないかもしれませんが、可溶画分に実験に必要な十分量えられるならそれでよしとすることもあります。また得られた蛋白が失活していないかなどは確実なことがいえないので、なんらかの確認ができればそれに越したことはありません。 IPTGでovernight誘導しているようですが、２ー３時間の誘導では場合によってはInclusion bodyがあまりDevelopしてなく、可溶化しやすいか可溶画分にまだタンパク質がある場合もあります（２ー３時間でもほとんどInclusion Bodyに取り込まれてしまうケースも多いですけど）。 Heat shock proteinを一度４０度ぐらいに上げて誘導するというのも見たことがあるなぁ。

(無題) 削除/引用 No.6448-5 - 2017/11/09 (木) 16:24:37 - 中年 18℃で培養して改善が見られたことがあります。

ご返信ありがとうございます 削除/引用 No.6448-4 - 2017/11/09 (木) 15:23:56 - あ mon様 ご返信ありがとうございます。 確かにAIMなら勝手に誘導がかかってうまいこといきそうです。早速試してみます!ちょうど今から前培養するところなのでグルコースの添加も試してみます!

(無題) 削除/引用 No.6448-3 - 2017/11/09 (木) 14:50:47 - mon TBベースの処方もありました。 ttp://grisp.pt/category/grisp/auto-induction-media なお、前培養はGlucoseを1%添加して(Lac promoterの漏洩発現を防いで）、欠失クローンの出現を防いだ方がよいですよ。

(無題) 削除/引用 No.6448-2 - 2017/11/09 (木) 14:40:35 - mon Auto Induction Mediumを使ってみては。培養は楽です。 市販もされていますが高価です。 25℃培養と組み合わせてもよいと思います。 ttp://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/8/pdb.rec12297 http://grisp.pt/docs/gcm18-2xyt-broth-aim.pdf

タンパク質のinclusion body 削除/引用 No.6448-1 - 2017/11/09 (木) 13:58:40 - あ 　現在タンパク質発現の実験を行っているのですが、その発現したタンパク質について質問です。 　操作の手順は、初めに大腸菌BL21(DE3)株を(lac operatorの支配下に目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだAmp耐性ありの)プラスミドDNAで形質転換してLB/Amp寒天培地で37 ℃、overnightで培養します。そこからシングルコロニーを１つピックし3 mLのLB/Amp液体培地で30 ℃、overnightで振とう培養します。翌日その培養液1 mLを100 mLのLB/Amp液体培地に加え37 ℃、2h(OD600≒0.8程度になるまで)振とう培養して一度培養液を氷冷してからIPTG(終濃度0.1 mM~〜1 mMの様々な濃度で行った)を添加し25 ℃、overnightで振とう培養して集菌します(この時のOD600は4弱)。これを10 mM KPB bufferで懸濁し超音波細胞破砕によりcell freeにするとサンプルの可溶画分からは目的のタンパク質は少量しか確認できずほとんどが沈殿部分から出てきます。 　おそらく目的タンパク質が封入体を形成していると考えているのですが、もしその場合上記に示した操作方法をどのように改善したら良いでしょうか。ちなみにSHuffle株でも同様の操作を試しましたが結果に違いはありませんでした。

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