BioTechnicalフォーラム [293TでのFc融合タンパク質発現について。]

293TでのFc融合タンパク質発現について。

No.6536-TOPIC - 2017/12/22 (金) 07:16:24 - 293T

大変初歩的な内容だと思いますが、ご意見いただきたくトピックを立てました。宜しくお願いします。

293T細胞で分泌型Fc融合タンパク質を過剰に発現させようと考えています。
この時の精製としてはプロテインAビーズを用いる予定です。

ここで疑問に思うことですが、FBSは使用しても問題ありませんでしょうか？
また、FBSの代わりにITS培地を用いる場合もあるかと思いますが、使い分け等ありますでしょうか？
また、どれくらいのスケールでいかほどのFc融合タンパク質が回収され得るのでしょうか？

たとえな10cmディッシュ10枚分に一過性導入した場合、2-3日目に上清を精製したとしたら、いかほどのFcタンパク質が回収されえますでしょうか？ケースバイケースだとは思いますが、経験論から言っていただけますと幸いです。だいたい100マイクロgほどあればもう十分かと思っていますが、CHO細胞やCOS細胞などで作らせるのとはまた違うのでしょうか。非常に門外漢なことでして、ご相談したしました。どうぞよろしくお願いいたします。
　

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No.6536-2 - 2017/12/22 (金) 09:40:22 - mon

FBSに関して、少ない方が良いです。
理由1:非特異的吸着およびウシIgGの混入を減らす（proteinAには結合しづらいので問題にならないときも多い）
理由2: 粘性
細胞が増える必要が無い遺伝子導入後に2%(事前にcheck)に減らすのも有効です。
Advanced DMEM等なら1%でも大丈夫だと思います。低IgG FBSも市販されています。ITSを添加しても使用FBS量を減らせますが、脂肪酸を添加した方が良いかもしれません。

回収量に関して、遺伝子・ベクター・培地組成（培養条件）によってまちまちです。
通常のDMEM+2%FBSなら0.01~20ug/mL程度でしょうか。分泌タンパクなので2~3日ではなく、5~6日の培養（死滅し始める程度）まで培養した方が収量が増えます（misfolded proteinも増える可能性もあるので注意）。
発現量を上げる工夫は、培地をprotein(アミノ酸）-richする（非必須アミノ酸＋Glucose、TC-Yeastlate, Yeast Extractsの添加、pHを維持するためのHEPESの添加、市販培地の利用）、CMV系のpromoterならforskolinやバルプロ酸ナトリウム(VPA）の添加あたりが簡便です。
CHO細胞系なら32℃に培養温度を下げるのも有効です（増殖速度が落ちる）が、293細胞系では効果はないようです。
市販の高発現用ベクターや高密度浮遊培養系は高価ですが、条件検討の手間が少ない(～ない）ため生産性は高いです。悪くても20ug/mL～数100ug/mLは見込めます。
なお、293細胞よりCHO細胞の方が分泌タンパクの生産能力は高いです。コンフルエントになっても死滅しづらいのも有利です。

293TでのFc融合タンパク質発現について。

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No.6536-1 - 2017/12/22 (金) 07:16:24 - 293T

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