BioTechnicalフォーラム [組織からの蛋白の抽出について]

組織からの蛋白の抽出について

No.657-TOPIC - 2012/06/22 (金) 05:13:01 - たんぱく

基本的な質問です。
マウスの大腿骨をホモゲナイズして、蛋白の抽出を試みました。
conventionalなNP40 lysis bufferでは十分な抽出ができなかったため、残ったペレットを5%SDSでピペッティングしたところ、かなり溶解することができて、相当量が得られました。
前者と後者とでの蛋白分画にはどのような違いがあるのでしょうか。
殆ど同じということであれば、5%SDSで抽出したいと思いますが、ウエスタンブロットに何か影響があるのでしょうか。
　

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No.657-14 - 2013/04/02 (火) 23:19:23 - 小児科医師（ゆとり教育）

魚をあげるのか、釣竿をあげるのかという問題ですね。今の若者は、「やってみせ、言って聞かせて、させてみせ、ほめてやらねば、人は動かじ」を地で行かないと難しいかもしれません。。。

質問者の方は、「やってみせ」の段階なのだと思います。実験も状況に応じてオリジナルの方法を改変して柔軟に対応することが必要ですよね。教育もその人に応じて柔軟に対応することが重要だと思います。

私も、いつもそのことを肝に銘じて後輩や学生を教えています。

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No.657-13 - 2013/03/27 (水) 15:01:31 - ﾋﾟﾝｸ

気持ち悪いやりとりが・・・

解決しました	削除/引用
No.657-12 - 2012/06/28 (木) 01:05:11 - たんぱく

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No.657-11 - 2012/06/28 (木) 00:54:55 - 老婆心

こういう初心者に付け焼刃の知識を詰め込むようなことして、大丈夫なのだろうか。
しかも、最初の質問者の受け答えも、その心配に拍車をかける。

知識をひけらかしたい回答者の自己満足と中途半端で無責任な面倒見。それによって生まれる中途半端な知識を持ってしまい偉そうにすると勘違い者。そして下の人に適当に教えていく悪循環・・・そういう図が目に浮かぶ。

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No.657-10 - 2012/06/26 (火) 22:18:38 - (゜Д゜

SDS濃度は2%くらいでもたいていの蛋白質を十分可溶化出来ると思います。実際、SDS-PAGEのサンプルバッファーのSDSは2%くらいですし。
SDSには強力な蛋白質変性作用があるので、2~5%の高濃度の中で生物活性を維持してる蛋白質は実際にはほとんどないと思います。(*1)
なのであえて低温で行う必要があるのかな？ともおもいますが、もし必要があってon iceにしていてSDSの析出の問題があるなら、SDSの代わりにドデシル硫酸リチウム（LDS)を使えばいいと思います。LDSはSDSと同じように働くイオン性界面活性剤ですが、違いは低温でも析出しないことです。

[（*1）ただ0.01%とかそれ以下の非常に低い濃度のSDSはしばしば一部のプロテアーゼを活性化したりするこがあります。]

あと、高濃度のSDSと各種インヒビターを入れていることの因果関係はあまりないように思います。

いまはネットやプロトコール本から容易にプロトコールが入手出来ますが、自分の意図する実験目的や対象とする蛋白質にとって適切かどうかは誰にも分からないので、必要と感じたら、自分で条件検討したり部分的にオリジナルの方法を改変したりして柔軟に対応しなくてはならない場面がこれから何度となくあるとおもいます。そうした対応がスムーズに出来るためには、使用している主要な試薬の役割や性質、各ステップの操作の意味などのきちんとした理解が必要になってきます。なので実験しながら少しずつそういう知識も増やしていくようにしてください。そうすれば先々の研究の展開もだいぶ違ったものになってくると思います。

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No.657-9 - 2012/06/25 (月) 23:42:31 - たんぱく

レス、ありがとうございます。
QiagenのAllPrepのプロトコールに難溶性のペレットを5%SDSで溶解するようにとのことで、おそらくは各種のインヒビターを入れているためでしょうが、かなりの高濃度で自分は経験がありませんでした。
これではconformationはダメでしょうが、転写因子、あるいはリン酸化をみる程度であれば問題ないかと思いました。
ウエスタンでの発現解析はうまくいきました。
ただon iceですと結晶化しますし、扱いが難しいですね。

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No.657-8 - 2012/06/25 (月) 23:16:21 - (゜Д゜

溶けにくい蛋白質を可溶化するために使われる界面活性剤にはいろいろなものがありますが、蛋白質を可溶化する力はかなり差異があります。一般にNP-40やTriton X100などの非イオン性界面活性剤は,SDSやデオキシコール酸ナトリウムのようなイオン性界面活性剤と比べると蛋白質の可溶化能は劣ります。SDSは界面活性剤のなかでもとりわけ可溶化能が高く、他の界面活性剤よりも、より多様な蛋白質を可溶化する事が期待出来ます。あなたの見ている結果はNP-40では可溶化出来なかった蛋白質がSDSでは可溶化出来たという事です。とにかく出来る限り多種類の蛋白質をより多く得たいならばSDSを使うことでもよいと思います。一方で、微量蛋白質などでは抽出液の中の蛋白質の種類や量が増えると相対的に存在比は検出限界以下まで下がる恐れもあり得るので、もしNP40で目指すものが十分に可溶化抽出出来ているならばあえてここでSDSを使う必要なないかも知れません。この辺はケースバイケースなので、どのようなアプローチがより適切かは、あなたの目指す蛋白質や研究目的次第という事になります。

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No.657-7 - 2012/06/22 (金) 17:00:30 - み

buffer組成の意味を理解して実験しないと事故起こすよ。
テクニシャンなら訳のわからない液体で混ぜ混ぜしといてって言われたら、意味もわからず言われた通りやっておけば良いのですがね。

> 前者と後者とでの蛋白分画にはどのような違いがあるのでしょうか。

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No.657-6 - 2012/06/22 (金) 08:12:09 - 通りがかり

＞NP40、SDSって何ですかって返答されましても、ねえ。

やれやれです。少しは聞く耳と自分がどれだけ恥ずかしい質問をしているか、成長された時（するかわからないですけどね、これでは）わかると思います；

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No.657-5 - 2012/06/22 (金) 08:09:08 - Q

？
それがすべて何ですけども・・・。
をれがわかっていただけないとは・・・。