皆様ご回答ありがとうございます。
> 目的によっては、GSTは切断しなくてもいいのでは??むしろGSTあったほうがGSTをネガコンにおいたりできるので便利だったりなんてことはないですか?
文献に従いまして、固相化用のタンパク質はGSTを切断し、もう一方のタンパクをGST-fusionのまま用い、GST抗体で複合体形成を検出&GSTをネガコンにおく予定でした。
> そのまますすめるならば、プレートに固定したあとにバッファ置換でいいんじゃないんでしょうか。
タンパク質アミノ基を用いてプレートに固定化しようと考えておりまして、切断時に用いるTris系のbufferでは固定化を行うことが出来ませんので、固定前にbuffer置換が必要でした。
皆様のおっしゃるとおり、凝集を防ぐことが難しいようであれば、切断せずに固定化しもう蛍光標識など別の方法で検出する方法がよさそうですね。プレートへの固定方法の検討も行ってみようと思います。
化合物の評価を行うため評価したいタンパク質間相互作用以外の要因はなるべく取り除きたく、可能ならばGSTはすべて切断して用いたいという思いはあるのですが…
初歩的な質問かもしれませんが、タンパク質の精製を行ううえで、こういった凝集の問題はよく起こることなのでしょうか?
また、GST-fusionタンパク質を固定化しGSTをネガコンとして用いる場合、どちらも固定化されるタンパク質量をそろえる必要があると思うのですが、例えばGST-fusionタンパク質とGSTをそれぞれ固定化し、蛍光標識GST抗体で検出したとして、蛍光量から固定化されたタンパク質量を単純に比較してよいものなのでしょうか? |
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