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(無題) 削除/引用 No.7067-5 - 2018/07/12 (木) 07:21:53 - Native PAGE beginner おお様、 引き続きありがとうございます。心から感謝しております。 > ずばり答えることは難しいですが、たんぱく質に影響が少ない界面活性剤で第一選択といえるかもしれません。 ありがとうございます！ではまずTriton X-100で可溶化してみます。 > どの界面活性剤変性作用は弱く非変性条件ということでよく使われますが、タンパクの影響は１００％否定ができません。ただ、あなたはSDS入りのバッファーにゲルをつけてからTransferする予定のようなので、ある程度その状況で変性を覚悟してますよね。 自分の書き方が混乱を招いてしまいましたが、私の実験目的は非変性タンパク質を泳動し、組替えタンパク質でファーウエスタンを行うというものです。ただ、私の組み替えタンパク質がファーウエスタンに使える証拠はありません。そこでせめて結合相手がここの位置にいますよ？ということを示すために（すみません、これをポジコンといいました。）、ファーウエスタンとは別に泳動後のゲルをSDS処理し、変性させたものを、結合相手に対する抗体（いつもSDSPAGEに使っている抗体です。）で通常のウエスタンをしようと思っています。抗体でウエスタンなので、必ずバンドは出るはずです。その位置に結合相手がいるという証拠をもとに、実際にファーウエスタンを別の非変性ゲルで行うというものです。 > ネイティブのタンパクの泳動で、まあまあきれいにいくと思うのはTris-glycineのシステムで、SDS-PAGEのSDSを抜いたものです。ただこの方法はStacking gelにｐH６．８のバッファーを使うのでDeoxcholateはちょっと無理かもしれません（酸性で沈殿するので）。 私が修士の時に行なっていたNature PAGEはやはりSDSを抜いただけのTris-glycineシステムでした。ただ、スタッキングゲルは使わず、セパレーティングゲルのみでした。スタッキングを使わなかった理由はわかりません。指示にしたがっただけでした。 pHは修士の時と同様、pH8.8でまずやってみます。 ちなみに修士の時には、LPS受容体を組み替えタンパク質として調製し、そこへLPSを加えてインビトロで２量体を作らせ、それをナイティブページで見ていました。

(無題) 削除/引用 No.7067-4 - 2018/07/11 (水) 14:04:25 - おお 一般的でないというのは確かにSDSPAGEのように頻繁に使われる方法でないということでもありますが、同様にいろいろなやり方があるし、フレキシブルに実験にあった系を作ったりしてやっていることもあったりするということもあります。たとえばEMSAとかもネイティブな状況で泳動していますし。 なのでどんな系を使うのかは少し気になります。 ＞細胞をTriton X100で可溶化させた場合、nonionic 界面活性剤ですが、タンパク質は影響を受けますでしょうか？ ずばり答えることは難しいですが、たんぱく質に影響が少ない界面活性剤で第一選択といえるかもしれません。ただものによってはあまりよくない場合もあります。よりマイルドなものであれば選択肢はまあまああるかもしれませんが、Octyl glucoside、Octyl Maltosideなどは膜タンパクではよくTritonより弱いものとして使われることがあります。Octyl Maltosideなどはミセルが形成されてもそのサイズが小さいのでミセルが泳動の邪魔になるということはないでしょう。Tritonはミセルは大きくたぶん数十ｋDaぐらいの大きさになると思いますけど（記憶はあいまい）、だから邪魔をするかはなんともいえないです。 マイナス電荷をもっているけどDeoxycholateなどはSDSの代わりのキャリアーになってくれる可能性はあります。これもミセルは大きくない。 Chapsは両方の電荷を持っていますがたいていのｐHの範囲内でニュートラルなので使えるかもしれません。 どの界面活性剤変性作用は弱く非変性条件ということでよく使われますが、タンパクの影響は１００％否定ができません。ただ、あなたはSDS入りのバッファーにゲルをつけてからTransferする予定のようなので、ある程度その状況で変性を覚悟してますよね。 ネイティブのタンパクの泳動で、まあまあきれいにいくと思うのはTris-glycineのシステムで、SDS-PAGEのSDSを抜いたものです。ただこの方法はStacking gelにｐH６．８のバッファーを使うのでDeoxcholateはちょっと無理かもしれません（酸性で沈殿するので）。 いちどSDS抜きTris tricineでネイティブをやった文献を見たことがありますが、ゲルのBufferのｐHをオリジナルの８．３（８．４やったかもしれん）から８．８にするとセパレーションがよくなったというのをみたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.7067-3 - 2018/07/11 (水) 10:38:18 - Native PAGE beginner おおさま、 BNは今の所考えていません。まずはできるだけシンプルな系でうまくいくかどうかを通常のNative PAGE で検討したいです。 見たいのは膜タンパク質へのFar-westernができるかどうかです。 ポジコンとしては、Native PAGE後、SDSを含むバッファーでゲル内タンパク質をSDS化させ、PVDF膜に転写。その後、通常の抗体を用いたウエスタンです。 その同じ高さに、リコンビナントを使ったFar-westernでバンドがでるかどうかが実験の目的です。 > 一般的とは言えませんが必要ならやるでしょう。 やはり一般的では無いんですね。 たとえば細胞をTriton X100で可溶化させた場合、nonionic 界面活性剤ですが、タンパク質は影響を受けますでしょうか？？もちろんSDSはマイナスに帯電しているので、タンパク質がSDS化されるとNative PAGEでは影響を受けそうですが、Triton X100を可溶化に使った場合、泳動に影響を与えるとしたらどういったメカニズムでしょうか？ご存知でしたら教えていただけませんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.7067-2 - 2018/07/11 (水) 07:05:45 - おお Blue Nativeなどいくらか系がありますからそれによって変わってくると思います。何が見たいかにより系の選択も変わるかもしれません。 >セルライセートでのNative PAGEというのは一般的にやられれているのでしょうか？ 一般的とは言えませんが必要ならやるでしょう。

Native PAGEをやろうと考えています。 削除/引用 No.7067-1 - 2018/07/11 (水) 06:26:21 - Native PAGE beginner Native PAGEをやろうと考えています。 サンプルはセルライセート。高度にシアル酸化されてる膜タンパク質へのFar-westernを考えています。 Native PAGE自体はリコンビナントを使った実験では行ったことがあるのですが、セルライセートとなると初めてです。興味あるタンパク質は高度にシアル酸化されているので、おそらくネットチャージはマイナスに荷電されていることが期待され、きちんとプラス方向への泳動がされるのではと期待しています。 セルライセートでのNative PAGEというのは一般的にやられれているのでしょうか？ 界面活性剤はこれを使った方が良い、など提案がありましたらどうぞご教示いただけませんか？ よろしくお願いいたします。

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