BioTechnicalフォーラム [なにをしてもコンタミが解消できません。たすけてください。]

(無題)

No.7277-31 - 2018/10/12 (金) 20:47:28 - コンタミ

スレ主です。

いろいろありましたが、どうやら解決しました！
皆様の数多くのアドバイスのおかげです。
コメントをくださった皆様、本当にありがとうございました。

多くの意見があったように、水をヌクレアーゼフリー（市販）のものに替え、それでプライマー、酵素希釈に利用しました。
それに加えて、プライマー、試薬など全てを新品にして水も上記のように分子生物学用のものに変えたため、解決したのは当然と言えば当然なのですが、皆様の知見が無ければ今も悩んだままでした。
もしかすると、ＤＮＡ　Ａｗａｙでピペット内外部、実験用品を清掃したこともよかったのかもしれません。
"これが原因だった"と明らかにわかるものが無いので若干モヤモヤが残りますが(笑)、このスレの内容や今回の経験を後輩に引き継いでいこうと思います！

(無題)

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No.7277-28 - 2018/10/05 (金) 17:59:43 - コンタミ

皆様ありがとうございます。

サンプルなんですけど、遺伝子発現とかではなくgDNAです。
それの検量線法でリアルタイムを使っているという状況です。
説明不足失礼致しました。

いままで条件が重なってたまたま良くなっていたというのにハッとしましたが、
十年近くずっと上手くいっていたプライマーなので、
それは可能性は低そうかなと思います。。。。
同じ理由で、プライマーダイマーも可能性は低いように思います。
いままではうまくいっていたので。
それにゲルで流すと同じ位置にバンドが出ます。

そう考えるとやはりMQかオートクレーブなのかなーと思います。
真核のgDNAですし、割と特異的な領域なので、
バクテリアの混入をリスクとしてオートクレーブ無の新品の購入した水でイチからやり直してみようと思います。
また報告させていただきます。

皆様本当にありがとうございます。

(無題)

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No.7277-26 - 2018/10/05 (金) 11:27:27 - おお

モデル生物で何らかの発現とか見ていればクリーンベンチとか大げさに思えるけど、どうですかねぇ、そのへんのホコリにももしかしたらいそうな微生物なども対象になりえるならクリーンベンチもあり得る選択なのかなぁと思ったりもする

(無題)

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No.7277-25 - 2018/10/05 (金) 09:43:53 - asan

ネカコンでもバックでCtがでることが避けられない場合もありますよ。
Ct値が同じ場所出ててくるなら何かのコンタミの可能性はありますが、Primerの大元がコンタミしてる場合もありますし、もともとCt値が35に近いようなexpressionを見てるとかないですかね？

増幅してるものがprimer dimerやコンタミかを知りたければ増幅したサンプルをゲルで泳動してみればサイズで大体わかります。

もちろんコンタミの可能性もありますが、完全なクリーン条件でやってない以上非特異的な増幅やダイマー、その他が後半ででてくることはありえます。本来は完全な条件でやるべきでしょうが多くの場合差が取れる条件には問題ない場合もあると思います。一般的な範囲で気をつけるのは大切ですが、クリーンベンチまで行ってわざわざqPCRのサンプルを全部調製してるラボを自分は知りません。

Ctが近いならもともとprimerが良くないとか、別のプライマーがコンタミしてるとか色々ありそうなので、とりあえず変えられる試薬は一式新調して、プライマーを新しく買ってみるとかピペットマンやチップを新しくするとかしてみないですかね？フィルターチップとか使ってますか？プライマーのクオリティがもともと悪かったが、以前は条件との兼ね合いでたまたまうまく行ってたなんてことはないですかね？

(無題)

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No.7277-23 - 2018/10/05 (金) 00:44:35 - たろう

MQ水をオートクレーブするのは悪手の可能性が高いです。
オートクレーブが原因なら、市販の水にしなくても、出始めの0.5L程度を捨ててからMQ水を採取し、オートクレーブしないようにしたら解決しそうです。

ところで、オートクレーブが原因で実験結果がおかしくなったとしか思えない状況のときに、オートクレーブをよく掃除したら解決したことがあります。
オートクレーブを綺麗にしておけば問題がおきづらいということがあるかもしれません。

(無題)

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No.7277-22 - 2018/10/04 (木) 16:10:26 - cDNA

ピペットマンのコンタミの話題はよく出ますが、先にピストンを押した状態でチップを付けて、液体を吸引し、それを一回だけ吐き出す。（ピペッティングはしない）という条件では仮にピペットマンがコンタミしていても、まずサンプルには入ってこないと教わったのですが、甘いですか？

(無題)

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No.7277-21 - 2018/10/04 (木) 15:24:04 - 銅

Lancetの論文は落ちていました
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0140673690927409

ただ元はこっちっぽいけれどアクセスできなかった
Porter‐Jordan et al Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives caused by contamination with fragmented DNA. J Med Virol. 1990 Feb;30(2):85-91.

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/jmv.1890300202

(無題)

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No.7277-20 - 2018/10/04 (木) 13:19:00 - SYBR master

元論文はこれ、だけど手元にはもうコピーも無い。
Porter-Jordan K, Garrett C: Source of contamination in polymerase chain reaction assay. The Lancet 1990, 335(8699):1220.
Pdfも落ちてこないので、これを引用しているreviewがこれで、そこにオートクレーブに関しての記述があります。
Borst A, Box A, Fluit A: False-positive results and contamination in nucleic acid amplification assays: suggestions for a prevent and destroy strategy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2004, 23(4):289-299.

出典は書かれていませんが、RocheのPCR application manualにもオートクレーブに関していくつかの注意事項が書かれています。以前は日本語版もあったのですが、現在は英語版のみですがpdfをダウンロードできます。

[栄研　lamp　コンタミ]でgoogleで検索したときのトップヒットの所にある、資料で、栄研化学が出しているLAMPでの増幅における注意点が書かれているpdfをダウンロードできます。そこにもオートクレーブに関していくつかの注意事項が書かれています。

(無題)

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No.7277-19 - 2018/10/04 (木) 12:36:57 - コンタミ

皆さん親身になって様々なことを教えていただき、本当にありがとうございます。

個別に返信できなくて、申し訳ありませんが、
ちょっとMQ水を疑ってみようと思います。
また、オートクレーブも汚染されているのでは？とも思ってきました。（疑う余地がもはやそこしか無い）
いままでは、MQ水をオートクレーブしていましたが、それを辞めて、
教えて頂いたDNA-Freeの水を購入して試薬の調整をしようと思います。
なお皆様が仰るようなエアロゾルの件もありますので、クリーンベンチ内で行うことも心がけてみようと思います。

ちなみに生物種は海洋性の単細胞藻類です。

また、報告させていただきます。

(無題)

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No.7277-16 - 2018/10/03 (水) 19:05:46 - SYBR master

PCR溶液の調整のそばで、電気泳動またはオートクレーブが行われていませんか？電気泳動のbufferが蒸発するとき、ウェルから漏れたDNAも一緒に空気中に拡散している可能性が高いです。実際PCR manualでは電気泳動を行う部屋と、溶液調整の部屋を物理的に隔てることが推奨されているはずです。また、PCR産物だけでなく対象生物などを廃棄するときにオートクレーブすると、オートクレーブの蒸気中にDNAが混入して部屋全体に拡散するとの論文もあります(たしかCytomegalovirusだったかな）。この場合、空気中に拡散したDNAは静電作用で、チューブやチップ等のプラスチック製品に付きやすいです。ちなみに、DNA抽出用のカラムもほとんどがプラスチックであり、カラムにDNAがコンタミしているとの論文も複数有りますので、それらの保存についても我々の研究室ではかなり気をつけています。

NTC用のDWについてですが、MilliQは基本的にはDNA-freeですが、採水のノズル等プラスチックである場合、汚染されている可能性は否定できませんし、微生物DNAで汚染されているという論文もあります。たぶん何を信じれば良いのか解らなくなっていると思いますので、DWに関しては、DNA-freeである市販品を一度試した方が良いかもしれません。少なくとも、市販品のDW中に、あなたが増やしたいDNA配列が混入している可能性は限りなくゼロに近いです。PCR用のDNA-free waterはあほらしい位高価ですので、お勧めはGibcoのUltraPure DWで、少なくともDNA-freeであることを我々は確認済みです。

以上ご参考になれば。

(無題)

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No.7277-15 - 2018/10/03 (水) 19:02:38 - SYBR master

また、UV照射ですが、結構いろいろな論文や書物等でこれまで「効果あり」とされてきましたが、現在の法医学関連や古代DNAを取り扱う分野では「全く効果無し」とされる論文も多数出ていますし、疫学等でコンタミが頻繁に問題になっている研究室では、体感的にUV照射は気休め程度であると思われているはずです。

特にクリーンベンチでのUV照射は全く効果が無いです。もしUV照射するなら、今の研究室にあるかどうか解りませんが、ハイブリ用のクロスリンカーで、照射源から10 cm程度の位置で照射しないとほとんど効果無いとの報告があります。ただ、UV照射によって劣化したプラスチックから、PCRを阻害する物質の漏洩も示唆されていますので、個人的にはUV照射はお勧めしません。

(無題)

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No.7277-14 - 2018/10/03 (水) 19:01:33 - SYBR master

ピペットのDNA除染ですが、以前感染症の疫学に拘わっていたときに、同様のコンタミ問題が生じたときにピペット内部を洗浄してみましたが、やり方次第ではあまり効果は無いです。論文等で効果的であるという除染方法は、ピペットを分解して、ノーズの部分とOリングとそのアタッチメントを0.5-1％の次亜塩素酸液もしくは市販のDNA除去剤(DNA away等)で、1〜2時間浸けておいてから、蒸留水で徹底的に洗うことです。汚れがひどいときは一晩浸けておいても良いとされていますが、ピペットの素材によっては劣化を促しますので注意してください。また、次亜塩素酸や除去剤が少しでも残っていると、PCRが走らなくなりますので、蒸留水での洗浄は徹底してください。金属部分はDNA除去剤等で拭き取って、蒸留水で拭き取り洗いを繰り返してくください。浸けると錆びますので。

ただ、我々は、これら方法を試してみましたが、ある程度の除染効果は認められましたが、最終的には新品のピペットに取り替えPCR専用とし、かつ疎水フィルターに変更した方が費用対効果も高いと判断しており、実際にそのように運営しています。もちろん、クリーンベンチもPCR専用を用意しています。

長いので、4つに分けています。

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No.7277-13 - 2018/10/03 (水) 19:00:09 - SYBR master

フィルターチップは取り扱う液のエアロゾル等からピペットが汚染されることを防止することが目的であり、既に汚染されたピペットからの試薬類へのDNAのコンタミを防止することは基本的には難しいです。

一般的なフィルターチップのフィルターのポアサイズは10-40 microメートルですが、約300 bpのDNAの長さは約100 nmであり、これが凝集状態だと直径はさらに小さい球状ですから、ピペット内部の汚染由来のDNAが乾燥していて、剥がれ落ちれば簡単にフィルターのポアを通り抜けます。あと可能な限り、DNAやRNAの取り扱いでは、疎水性のフィルター(ThermoのARTやWATSONのハイパーフィルター）を使用することをお勧めします。疎水性の方が、親水性よりピペットへの汚染防止力は高いです。ただ、疎水性でもピペットからのコンタミは前述のように防止できません。

(無題)

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No.7277-11 - 2018/10/03 (水) 00:39:38 - cDNA

私はまずは水を疑え、というラボで育ったので、MQを変えた、というのがどのレベルの話か気になります。余所のラボや別の装置、という意味か、くみ直しただけか。不適切に管理されたMQはトラブルの元です。

MQをその手前のRO水や蒸留水に変えて、フィルターかけた物やオートクレーブしたもので試してみたいです。

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