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FACSでもなくMACSでもなく... トピック削除
No.7699-TOPIC - 2019/02/18 (月) 05:44:58 - 櫓冬
初めまして、質問させてください。

ある膜表面マーカーを発現する細胞を単離してきたいのですが、ある処置を加えた癌セルラインのうち0.001%の細胞がそれを発現しているだろうと計算上予想しています。

ただ、0.001%ではFACSでソートするのはたとえ癌セルラインであっても厳しいですし、MACSを何度かかけてエンリッチしてからFACSに持ち込むのもうまくいきませんでした。

表面マーカーを認識する抗体は豊富に持っています。
どうにかしてFACS、MACSせずに”初期段階”で濃縮するステップをかませられないかと考えています。
0.001%を0.1%もしくは1%まで濃縮できれば、そこでようやくFACSやMACSに行きたいです。

抗体を何かでラベルすることでその細胞だけが生存し、ラベルしなかった細胞は死滅するようなうまい仕組みがあればいいのですが、そんなことはないと思います...なにかアイデアがありましたらシェアしていただけませんでしょうか?

宜しくお願い致します。
 
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No.7699-6 - 2019/02/18 (月) 14:23:06 - asan


0.0001%でも何度か連続でFACSソーティングとかすれば濃縮できると思います。

ゲーティングストラテジーで最初にざっくりと上位数%の分画を取得して、
それを再度FACS展開すれば1/100にでもなるでしょ。

回収した後培養してポジティブな細胞を増やせるならもっと濃縮できるかもしれませんけどね。


フェノタイピングによる遺伝子のクローニングとかでにたようなことは過去にやられてます。

(無題) 削除/引用
No.7699-5 - 2019/02/18 (月) 13:31:17 - おお
抗体とDNAのコンプレックスをつくって特異的な細胞にそのDNAを発現させるような試みはありますが、その効率があなたの実験で現実的なものかどうか、、、

(無題) 削除/引用
No.7699-4 - 2019/02/18 (月) 11:12:23 - おお
その発現している細胞は継続的(恒常的)にその遺伝子を発現しているとお考えですか?ここの細胞が発現したりしなかったりしていて、全体的にそのくらいのポピュレーションにみえるということはないですか?

後者の場合濃縮できたとしても、培養しているうちに発現している細胞がへる可能性があるので、、、

(無題) 削除/引用
No.7699-3 - 2019/02/18 (月) 10:28:58 - 櫓冬
TK-1様

ありがとうございます。
根拠に関しては、研究開発の部分が関わってくるので、ここで詳細に述べることはできません。
本当に申し訳ありません。

やはり無理でしょうか。。

(無題) 削除/引用
No.7699-2 - 2019/02/18 (月) 07:56:38 - TK-1
>[Re:1] 櫓冬さんは書きました :
> 初めまして、質問させてください。
>
> ある膜表面マーカーを発現する細胞を単離してきたいのですが、ある処置を加えた癌セルラインのうち0.001%の細胞がそれを発現しているだろうと計算上予想しています。
>
根拠はなんですか。

FACSでもなくMACSでもなく... 削除/引用
No.7699-1 - 2019/02/18 (月) 05:44:58 - 櫓冬
初めまして、質問させてください。

ある膜表面マーカーを発現する細胞を単離してきたいのですが、ある処置を加えた癌セルラインのうち0.001%の細胞がそれを発現しているだろうと計算上予想しています。

ただ、0.001%ではFACSでソートするのはたとえ癌セルラインであっても厳しいですし、MACSを何度かかけてエンリッチしてからFACSに持ち込むのもうまくいきませんでした。

表面マーカーを認識する抗体は豊富に持っています。
どうにかしてFACS、MACSせずに”初期段階”で濃縮するステップをかませられないかと考えています。
0.001%を0.1%もしくは1%まで濃縮できれば、そこでようやくFACSやMACSに行きたいです。

抗体を何かでラベルすることでその細胞だけが生存し、ラベルしなかった細胞は死滅するようなうまい仕組みがあればいいのですが、そんなことはないと思います...なにかアイデアがありましたらシェアしていただけませんでしょうか?

宜しくお願い致します。

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