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(無題) 削除/引用 No.8164-5 - 2019/08/16 (金) 08:11:54 - AP どの程度、変性したプラスミドが生じているかは以下のような方法で検定できます。 電気泳動してcccのバンドがダブレットになっていないか。未変性のバンドのすぐ下に見える変性プラスミドがどのくらいあるか。 制限消化して切れ残るフラクションがどのくらいあるか。

(無題) 削除/引用 No.8164-4 - 2019/08/16 (金) 08:00:01 - AP アルカリ変性により、プラスミド二重鎖の解離が進みます。これはインタクトでニックのないcccは、開放末端のない環状なので、一分子の中で部分的にでも解離が起こると、プラスミドが全体の対合に歪みを生じます。これは通常のプロトコールに従っていてもある程度起こりますが、処理が過剰だと変性プラスミドが増えてきます。 これによる顕著な影響は制限酵素で切れなくなること。 部分的な解離だとわかれば、目的の実験で使えるか否か、想像がつくでしょう。 例えばシークエンスやPCRの鋳型なんかなら無問題ですし、大腸菌や細胞に導入する実験も、宿主内の修復機構があるので問題は少ない。

(無題) 削除/引用 No.8164-3 - 2019/08/16 (金) 05:21:03 - mii おお様 そうなんですか...勉強になりました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.8164-2 - 2019/08/16 (金) 05:15:10 - おお 不都合はあります. ちょうきNaOHにさらすと、変性が進みもとの環状に戻らないことがあります。ただ必ずしもおかしくなるとは限らないので進めてみてもいいかもしれません。

MidiprepのP2に25分付けてしまいました 削除/引用 No.8164-1 - 2019/08/16 (金) 05:00:35 - mii 大変初歩的な内容で申し訳ないのですが相談させていただきたいです。 大事なサンプルだと分かっていながら、ミディプレップ中に話しかけられてしまい、P2を加えてから25分後にP3を加えざるを得ませんでした。 もう一度大腸菌を増やし直すのが正しい解決法だとは存じますが、実際問題、5分を大幅に超過することで得られる不都合はありますでしょうか？

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