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(無題) 削除/引用 No.8330-5 - 2019/10/21 (月) 17:56:36 - mon >どうしてウエスタンではだめ 個々の抗体のそれぞれの抗原に対する親和性が大きく異なる事（＋抗体濃度が異なる、場合によっては二次抗体の親和性が異なる）からです。 同じ抗体でもブロットが異なればシグナル強度は変動します（全く同じ効率でブロットするのが難しいため）。 同じエピトープに結合する異なるモノクローナル抗体同士でも、同じブロットで同じ濃さ（シグナル強度）のバンドを得るためには、それなりの試行錯誤が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.8330-4 - 2019/10/21 (月) 10:21:35 - ちき 検量線をひけばqRT-PCRで絶対定量が可能なこと、因果関係を示したいなら何らかの実験的介入をする必要があることはすでに指摘がある通りだと思います。 相関関係が示したいだけなら、二つの酵素の正確な比がわからなくても、referenceになる細胞との間でそれぞれの酵素の発現変化(比)がわかれば、比の変化は計算可能ですね。理屈上は。

(無題) 削除/引用 No.8330-3 - 2019/10/21 (月) 09:23:23 - asan ＞この場合にもプライマーの増幅効率に違うがあれば、結果を比較できないとは思います コピー数を出すだけならそれぞれのprimerに対してコピー数が既知のサンプルの希釈系列を用いて程数値をだすことは可能です。 ただし、 ＞状況証拠からその機序としてベータ酸化律速酵素が、解糖系律速酵素の発現量に比べ高いから、と仮説を立てています。 ということを証明するなら、一般的にはその律速酵素の発現量を落としてやったら細胞の代謝fluxが変化したとかそういうloss of function, gain of function 実験をやらないと必要（充分）条件にはならないでしょう。 ちなみに一般的にはメタボローム解析だけではflux(代謝経路の流れ）はわからないので、fluxを知りたければ安定同位体標識された代謝出発物をパルスして取り込んでfluxを定量比較して初めてそれが言えます。ま、どこまで厳密にやるかはそれぞれですけどね。

(無題) 削除/引用 No.8330-2 - 2019/10/21 (月) 04:59:30 - おお その細胞だけで違う酵素の蛋白量ましてはmRNA量を比較しても説得力がないと思いますが。解糖系が優位な細胞とか、その細胞が何らかの要因や病態のためにそうなったのなら、元の状態の細胞があれば比較対象ができるので説明しやすいです。 もしその細胞のみで発現量でやるなら、蛋白を重量単位で測定して、それから単位時間あたりの生成物を計算して、両方のATP（が最終産物としてかんがえてるなら）の産生量がいくらかなどまで推察しないと結論が出た気にならないです。さらにそうしたとして、次に責められる可能性がある点は、その蛋白は１００％活性化しているのか、ちゃんとワークするような場所に局在しているかなど。 ＞この場合にもプライマーの増幅効率に違うがあれば、結果を比較できないとは思います 個々のケースでどうかというのはそれぞれあたってみないとわかりませんが、増幅効率はほぼ理想的な数値が得られるプライマーをデザインすることで、比較ができることを担保してます。それでも異論があるとは思いますが、ブレが気になる場合や、より厳密な解析が必要な場合、またはプライマーにする配列に選択肢がない場合など検量線を引けばいいわけで、方法論として比較できないというわけではありません。

2つの異なる遺伝子の発現の差について 削除/引用 No.8330-1 - 2019/10/21 (月) 02:14:51 - 遺伝子発現 qRTPCRとウエスタンを行なっています。 解糖系とベータ酸化の各律速酵素のウエスタンを行なったところ、後者の方でバンドが検出され、前者では薄くではありますが検出されました。 もちろん使用した抗体はそれぞれ違います。 この細胞のメタボリズム解析から、ベータ酸化優位な細胞であることがわかっています。 状況証拠からその機序としてベータ酸化律速酵素が、解糖系律速酵素の発現量に比べ高いから、と仮説を立てています。 その仮説を証明する方法として何があるかなと考えています。 このウエスタンの結果は一見予測できたことですが、もちろん抗体の反応性の良し悪しもあるでしょうから、全く異なるタンパク質を比較することはできないと思っています。 そこでRTPCRを行うことにしました。 もちろん設計するプライマーも2者間で異なります。 この場合にもプライマーの増幅効率に違うがあれば、結果を比較できないとは思いますが、ただ、論文ではそういったデータを示す論文は多いと思います。 たとえばインフラマソームには数種類知られています。 ある臓器でどのインフラマソームが発現しているかをqRTーPCRを行なっている論文は多いです。 NLRC4、 NLRP1、NLRP3などです。 どうしてウエスタンではだめで、qRTーPCRではそれが可能なのか（プライマー増幅効率に違いがある可能性を無視しているのか）が気になっています。 コメントいただけたら幸いです。

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