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(無題) 削除/引用 No.8494-9 - 2019/12/15 (日) 13:43:11 - けんぼう iPCRを過去に何度もやりました。そして概ね成功しています。 iPCRは何回か同じ条件でトライすると上手く行くことが多々あります。 ある程度不確定要素がある実験系で、確率的な要素があるので、何度か同じことをやってみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.8494-8 - 2019/12/15 (日) 11:41:02 - cDNA アニーリング温度を上げた方がいいかと思います。 プライマーがすべてのテンプレートに結合しているとは考えにくいのですが、もし一つのテンプレートの二か所に結合していると、目的のものは3'のところで合成が止まるので目的のプロダクトは絶対に出来ないことになります。 今回出来てしまったものはそうやって合成が止まっているところに、本来3'のサイトに結合したものがヌクレアーゼ活性で削られてしまえばプライマーになれます。 アニーリング温度を上げる、プライマー濃度を下げる、ポリメラーゼ濃度を下げる、2ステップPCRにするなども効果的かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.8494-7 - 2019/12/15 (日) 02:16:15 - PCR asanさん、ありがとうございます。 > 教科書的には3'末端が１塩基でも存在するとPCRはかからないというのが一般的ですが、実際には3'に多少の末端がついていてもPCRはかかることはあります。 > これが、primer合成時の残存エラーのせいなのか走りませんが、現実的にはあります。 そうなのですか...ですが、プライマーの3’の配列がPCR産物には取り込まれないというのはどういうことなんだろうと思います... やはりアニール温度を上げるよりかは、プライマー配列を長くした方がいいのですね。 了解しました。まずは行ってみます。

(無題) 削除/引用 No.8494-6 - 2019/12/14 (土) 21:06:43 - asan 教科書的には3'末端が１塩基でも存在するとPCRはかからないというのが一般的ですが、実際には3'に多少の末端がついていてもPCRはかかることはあります。 これが、primer合成時の残存エラーのせいなのか走りませんが、現実的にはあります。 １つはこれをさけるためにはできるだけ3'の特異的な部分のを長くしてミスプライムしないようにすることは大きく効果的です。現実的には数100bpsのPCRプロダクトをプライマーとして使ってPCRをかけることも可能なので、40-50bps程度のプライマーは全く問題なく、長くなればなるほど、おそらく初期の段階では3’側のプライミングによってPCRがかかることになると思うのでエラーは起きにくくなると思います。 iPCR(という呼び方が正しいかしりませんが）は、数十bpのhomology末端が大腸菌の修復機構によって修復されることで成立する（と思われます）から、修復末端付近に共通配列があるとそれを抜かしてしまってる可能性は十分あります。複数のクローンをってそれが優位にでるということは、少なくともそういう修復が優位に行われているのでしょう。 個人的にやるなら、primerを長めのものに作り直して、1kbの部分が末端になるようにずらして作製します。ちなみに、この方法の欠点はprimer同士のセルフハイブリダイゼーションが起きやすいことが決定的になるので、トリックとして3'の部分をfoward reverseで5-１０塩基ぐらいずらしてやったほうが成功しやすいです。変異を入れる場所はできるだけホモロジーのある部分で前後のノリを十分に取ったほうがいいです。Taの温度は５０度はさすがに低すぎるので、５５℃ぐらいにはした方がいいです。鋳型は10-50 ng程度で15cyclesも回せば通常は十分でしょう。

(無題) 削除/引用 No.8494-5 - 2019/12/14 (土) 15:25:15 - PCR 独り言さん、ありがとうございます。 私も30近く回しています・・・。28です。 テンプレートの量は1と10 ngで50 ulのスケールでiPCRをしていますが、10 ugでバンドが出ていました。1 ngではうっすらでした。 切り出しのことを考えるとやはりbandは濃い方がいいと思うので、10 ngでligationに回しました。 にしてもプライマー領域がダブルで挿入されるというのもPCRの原理から考えると理解しがたいですね。。

(無題) 削除/引用 No.8494-4 - 2019/12/14 (土) 14:49:00 - 独り言 現象は異なりますが、私が昔、iPCRで頻発したのがプライマー領域がダブって導入されてしまうことでした。 結論としては、プラスミドテンプレートのiPCRですが30サイクルほど行ってしまうとそういうことが起きるのがわかりました。 それからは、iPCRは20サイクル程度にすることにしたら、問題が解決しました。

(無題) 削除/引用 No.8494-2 - 2019/12/14 (土) 10:55:50 - PCR ちなみに、アニール温度は50度でやっています...特に理由はなくPCRがかかりにくかったらいやだな...という理由でこの温度にしていますが、やはりこれが3’側のAにフォワードプライマーがアニールしてしまったからと考えた方がいいでしょうか？ あげるならば何度くらいまであげるべきなのか...

PCRの変異導入にもう二週間... 削除/引用 No.8494-1 - 2019/12/14 (土) 10:37:58 - PCR 恥を忍んで質問させてください。 iPCR法にて変異を導入しようとしています。 フォワード側のiPCRのプライマーには2塩基に変異を入れており、23塩基の長さです。（2箇所入れるならもう少し長くした方がとは今になっておもいますが...） オリジナルの鋳型のDNA配列は、 BBBBAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCCCC-----(1 kb)----AAAAAAAAAAAAAAAAAAADDDDD です。約1 kbほどあります。両端に同じ配列（A）があります。 遺伝子変異は5’側のAの一部に2つ入れたいです（仮にaとします）。 BBBBAaAaAAAAAAAAAAAAAAACCCCC-----(1 kb)----AAAAAAAAAAAAAAAAAAADDDDD そこでiPCR用のフォワードプライマーは5’側のAにのみハイブリダイズするように、フォワードプライマーは以下のようにデザインしました。 5’- AaAaAAAAAAAAAAAAAAACCCCC -3’ リバース側はもちろん、 5’- （相補的な）BBBB............................................. -3’ です。 ところが、このプライマーペアでPCRを行ったところ、以下のようなプロダクトが全てでした。 BBBBAaAaAAAAAAAAAAAAAAADDDDD つまり、プライマーによる変異は入ってはいますが、1 kbがごっそり抜け落ちていました。 おそらくフォワードプライマーが3’のAにハイブリダイズしてしまったのだと思います。 ただし、それにしてもおかしなことが起きています。 それは、フォワードのプライマー配列はCCCCが3’側に配置したにも関わらず、できてきたプロダクトはCCCCが入っておらず、DDDDになっていました。 これはあり得ないのではないか、と思い生気が抜けてしまいました。 すみませんが、このようなことは起こり得ますでしょうか？ アニール温度を高めにしてiPCRを行う予定ですが、それで果たしてうまくいくか...非常に精神を消耗しているこのごろです。

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