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(無題) 削除/引用 No.8612-8 - 2020/02/01 (土) 13:36:06 - ハッピーターン みさん ありがとうございます。 細胞内の染色は次のステップと考えていて、今はCD69で見てます。 刺激していない細胞ではCD3が染まっていたので、染色は問題ないかと考えています。CD3で染まりにくいのが何でかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.8612-7 - 2020/02/01 (土) 09:44:44 - み ３回の実験はそれぞれ方法が少しずつ異なるようなので単純には比較できませんね。 それとIL2, IFNgをFACSで評価されているようですが、分泌されるサイトカインですから細胞内に存在する画分をFACSで見れる抗体でそれなりのプロトコールで行わないと正しく検出されないでしょう。 asanさんが仰っているintra-FACSですよね。

(無題) 削除/引用 No.8612-6 - 2020/02/01 (土) 07:33:52 - ハッピーターン おおさん、asanさん アドバイスありがとうございます。 刺激と検出抗体は別のものです。刺激抗体に反応するような二次抗体で確認してみたら良さそうですね。 脾臓からの様々なリンパ球の混ざった状態で刺激しているので、T細胞の活性化としてCD3陽性でかつIL2(ないしIFNg、CD69など)陽性細胞が増加しているのを見たいと考えました。 一度目はそれらしい結果になったのですが、二度目、三度目はCD3が染まりにくく再現できず、今回のような可能性はないかと考えた次第です。 ビギナーズラックだったようです。 2回目は回収時にウエル内でピペッティングをしたので、それで固相化していたのが剥がれたのかと思い、3回目は播種前にウエルをPBSで洗い忘れたように思い、刺激時のCD3抗体が残ったままで染色抗体がくっつかなかったのかと考えました。 1回目は24時間刺激ですが、２.3回目は24時間以上だったので、internalizationで染まらなかった可能性もあるものでしょうか？ その場合T細胞だけどCD3が染まりにくいのか、CD3ネガ細胞(NK細胞？)が活性化されているのか、他のマーカーも追加してみないと分からないということでしょうか？ 単純にT細胞の活性化をダブルポジティブで確認したいだけなのですが、そんなに簡単でもないということでしょうか(涙)検証が必要ということですね。

(無題) 削除/引用 No.8612-5 - 2020/02/01 (土) 01:57:32 - asan 当然抗原の位置とかによってはコンピートする可能性はあると思います。 いずれにせよ、刺激を刺激した後TCR複合体がinternalizationを起こしますから染まらなかったことを指標に刺激が入ってるという言い方をする？のは一般的じゃないきがしますけどね。 それを見るぐらいなら, immediate early geneの活性化とか、活性化したT細胞の特異的マーカーとかを見ないと意味ないと思いますけど、、、。内部の活性化IL2産生量とかをイントラFACSで見てる論文とかも一応あった気はしますがー

(無題) 削除/引用 No.8612-4 - 2020/02/01 (土) 01:30:19 - おお 実験のプロトコールの問題点、疑問点を見つけたりする事によって今までの現象の見方が変わっていくということはこういう世界ではあるような気がしますし、こういうふうに色々考えることは自身が新しい実験を組み立てるのに役立つと思います。なので疑問としては評価ができると思いますが、以下の点はどうでしょうか？ 刺激用の抗体と検出用の抗体は同一ですか？ 刺激用の抗体はもしついていたとして検出されますか？ 確認作業ができませんか？ ちょっと突っ込んで考えてみてはどうでしょう。

(無題) 削除/引用 No.8612-3 - 2020/01/31 (金) 23:52:51 - ハッピーターン みさん ありがとうございます。 コートしておくのですが、それがピペッティングで剥がれたり、コート後の洗浄が不十分で抗体が残っていたりするとどうなのかな？と考えております。

(無題) 削除/引用 No.8612-2 - 2020/01/31 (金) 22:56:29 - み 刺激用の抗体は培養皿の底にあらかじめコートしておいてから細胞まくのでは？

リンパ球の活性化 削除/引用 No.8612-1 - 2020/01/31 (金) 22:47:16 - ハッピーターン 免疫実験、初心者です。教えてください。 T細胞をCD3、28抗体、IL2で活性化して、フローサイトメトリーで活性化されたか見たいです。 CD3抗体で刺激すると、これが細胞にくっついたままで、フローサイトメトリーの標識CD3抗体がくっつかない可能性はあるのでしょうか？ 新しい研究室で、教授も実験は詳しくないので細かいことを相談できず困っています。よろしくお願いします。

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