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(無題) 削除/引用 No.9508-17 - 2021/02/16 (火) 20:39:05 - G25 一応断っておきますが、Spot platingが最善の手段だと決めつけて、他の提案を貶そうというつもりじゃありません。 > mini prepをした残りの菌液を1ul つまり、そういう方法で、いわゆる「マスタープレート」を作っているというわけですね。 色々な流儀があっていいのですが、オーソドックスな方法ではないですね。コロニーを楊枝などで拾ったら、まずマスタープレートに植えて、次に液体培地やコロニーPCR反応液に浸けるのが教科書的な作法です。この方法で、マスタープレートにサテライトを見たことはありません。 アームチェアディテクティブを気取れば、 マスタープレートに生じたという「サテライト」は非形質転換体ではなくて、飛び散った培養液から生えた形質転換体ではなかろうか。ピペットマンなんか使っていて、第2ストップまでプッシュして空気で押し出すと、はぼ確実に残液が飛び散ります。 なので私はSpot platingなんかの時は、いわゆるリバースピペッティングで、第一ストップで吐出しています。

(無題) 削除/引用 No.9508-16 - 2021/02/16 (火) 19:34:05 - AA >mini prep産物を〜1ul程度 mini prepをした残りの菌液を1ul の間違いでした。

(無題) 削除/引用 No.9508-15 - 2021/02/16 (火) 19:06:00 - G25 打ち間違いが多かったので、書き直します。 >あくまで印象ですが、形質転換直後の菌液をスポットして果たして上手くいくのかどうかはそれ自体に一回条件を振る必要があると思いますし、ストリークして分離したほうがうまくいきそうな気がします。 スプレッドしてもバックグラウンドは非形質転換体で埋め尽くされているわけですよね（本当にストリークしているならいざ知らず。でも普通はしないよね）。そのなかから、適当な間隔のあいた形質転換体のコロニーを拾っているわけです。 スポットでもそれは同じこと、スプレッドしてプレートいっぱいに生やした状態から、その一部分を切り取ったというだけで、形質転換体、非形質転換体の密度は変わるものではないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.9508-14 - 2021/02/16 (火) 18:41:27 - s > 形質転換直後の菌液をスポットして果たして上手くいくのかどうかはそれ自体に一回条件を振る必要があると思いますし、ストリークして分離したほうがうまくいきそうな気がします。 まあ、こういうのは自分の経験からしか言えない訳で100%だいじょうぶかと言われると困りますが、プラスミドの大量調製目的のために、形質転換後の大腸菌を一時的にスポットしておく方法で、プラスミドの収率が極端に下がったり、rearrangementを起こしたりしたことはないですね。

(無題) 削除/引用 No.9508-12 - 2021/02/16 (火) 18:28:12 - G25 >mini prep産物を〜1ul程度プレートにスポットして どういうこと？

(無題) 削除/引用 No.9508-11 - 2021/02/16 (火) 18:18:05 - AA クローニング後のカットチェック〜シークエンス確認までの間のクローン保管のために、mini prep産物を〜1ul程度プレートにスポットしてストックを作ったりします。 希釈度や培養時間でうまく調整できるとは思いますが、シングルコロニーで突っついたあとの菌液でも、時間を伸ばすとサテライトコロニーと同じ要領で形質転換されていない菌も増えてきます。 (多分はじめに突っついたときに一緒に拾ってしまっているのでしょう) あくまで印象ですが、形質転換直後の菌液をスポットして果たして上手くいくのかどうかはそれ自体に一回条件を振る必要があると思いますし、ストリークして分離したほうがうまくいきそうな気がします。 (スポットと比べると1枚あたりのスループットは激減してしまいますが。。。)

(無題) 削除/引用 No.9508-10 - 2021/02/16 (火) 17:08:47 - G25 >細菌や酵母の懸濁液の希釈列を作って、寒天培地の上に5 uLずつくらいのスポットを並べてコロニーを生やすという手法があります。 あらためて調べてみたら、"spot plating technique"と言うらしい。

(無題) 削除/引用 No.9508-9 - 2021/02/16 (火) 14:55:15 - G25 タイターチェックのため、あるいは諸条件下あるいは系統間での生育を比較するなどで、 細菌や酵母の懸濁液の希釈列を作って、寒天培地の上に5 uLずつくらいのスポットを並べてコロニーを生やすという手法があります。 これを応用して、形質転換、回復培養後の菌懸濁液を一枚のプレートに並べてスポットしていったらどうでしょう。 希釈列を作るのはいらぬ手間なので、1スポット数〜数十コロニーになるように、使用するプラスミドやコンピーテントセルの量、回復培養に使用する培地の体積などを考慮して、1コンストラクト1スポットでいいんじゃないかな。 最悪、密に生えすぎてシングルコロニーをピックアップできなくても、寒天培地上で増殖しない非形質転換体の混入は排除できる。

(無題) 削除/引用 No.9508-8 - 2021/02/16 (火) 13:19:21 - 因循苟且 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?start=21;mode=view;Code=3321

(無題) 削除/引用 No.9508-7 - 2021/02/16 (火) 00:52:24 - おお コスト的なことはあるかもしれないが６Well Plateとか使うとすこしSimplifyはできるはず。 あと１０cmとかで撒く場合、グラスビーズを使うと塗る手間が省けて若干楽になると思う。 ミニプレップは９６穴タイプのやつでやるのでしょうか。ならまあ１００枚から数百といった感じですか？それともロボットでしょうか。昔クラボーでしたっけ自動でやってくれるやつがありましたね。 また、四角のプレートなら、Transformation、回復培養したものから、白金耳などでプラスミドにつき一本線というふうにすれば、１０ cm四方で、５、６個のプラスミドは扱えるのではないだろうか、もしかしたらもう少し多く扱えるかも。まあ円形でもそれぐらいはできるでしょうけど、配置とかあまり考えずに線を引いていくだけならやりやすいと思うので。

(無題) 削除/引用 No.9508-6 - 2021/02/16 (火) 00:27:05 - 774? ちょっと9508-5さんに同意かも． 100種くらいならプレートにまくんじゃないかなー， 4種ピザみたいな感じで． 30枚以下じゃん？ midiもバキュームつかって4セットくらいにわけてやれば 数時間以内に終わるけど，確かにmidiのが面倒そう．

(無題) 削除/引用 No.9508-5 - 2021/02/15 (月) 17:57:58 - s プレートにまくのが気が遠くなるほどの数のプラスミドっていくつぐらいだろう。 50種類のプラスミドがあるとして、自分の感覚としては、気が遠くなるのはプレートにまくよりもMidi prepをするほうだけど。 それはともかく、形質転換後にプレートにドロップし、ストリークせずに一晩培養して生えてきたパッチからひろうというのもやることがあります。これだと一枚に10種類以上はいけるでしょう。すでに回答がありますが、シングルコロニーをひろうというよりもプレートで選択かけるほうが重要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.9508-4 - 2021/02/15 (月) 17:24:36 - が Ampでしょ。おすすめしない。 transformationされていない大腸菌が大量に含まれるので（増えてくる）、結果的に収量が激減します。

(無題) 削除/引用 No.9508-3 - 2021/02/15 (月) 17:17:58 - AA ライゲーション産物ではなくて環状プラスミドの形質転換は効率が良いので、 やってやれないことはないような気もしますが、コンピテントセルのチューブの中で形質転換されたものがマジョリティになっているとは思えないので、そのまま液体培地へ行くのは私だったら避けるかなと思います。(選択圧をかけているとしても) 私だったら、1プレートに6プラスミドぶんずつくらい画線培養でまいて、翌日1コロニーを突っついてラージカルチャーへ進みます。

(無題) 削除/引用 No.9508-2 - 2021/02/15 (月) 16:51:57 - おお まあ実験次第だなぁ。 なにか交じる可能性 混じったものがプレドミナントになってしまう可能性 はつきものだと思う。

シングルコロニーピックアップ無しのMidiprepおけ？ 削除/引用 No.9508-1 - 2021/02/15 (月) 10:30:54 - e.coli Midiprepをする際、教科書的には 1. plasmidを大腸菌に導入 2. Amp+プレートにまく 3. シングルコロニーピックアップし培養 4. Midiprep だと思います。 ですが、今回Midiprepしたいプラスミドが大量にあり、全部プレートにまくのは気が遠くなる作業です。 次の工程を実施されている方はいますか？ 1. plasmidを大腸菌に導入 2. 液体培地（Amp+）で培養 4. Midiprep プラスミドは以前シングルコロニーピックアップし、Midiprepしたものですので、単一のプラスミドが含まれていると考えています。 どうぞ宜しくお願いいたします。

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