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(無題) 削除/引用 No.999-13 - 2012/10/19 (金) 13:50:11 - ふみ KENさん 色々教えて下さってありがとうございます。 私もEasy Dilutionを使っています。 これを使うと通常の吸光度による核酸濃度算出に支障をきたすのは難点ですが。 サンプル濃度を濃くすることについて、標的よってはよくない影響が出るので、希釈度を変えて検出の量比が保たれるかを私は確認しています。 1step法だとあまりそんなことを考えなくてよさそうですね。 プライマーダイマーができないような設計を心がけてはいても、サイクルを増やすとできてしまいますね。45サイクルでもno templateから増えないよいプライマーができることもありますが。 プライマーダイマーができてしまえば、増幅効率が核酸濃度算出に影響する方法であるSYBR Green法でもProbe法でも問題が生じる可能性があるので、プライマーダイマーができていないことを確認するのがよいと考えています。

(無題) 削除/引用 No.999-12 - 2012/10/19 (金) 13:40:21 - ふみ ?さんへ Probe法に難色を示したかったわけではありません。 うまく伝わるように書けなかったようですみません。 デジタルPCRは、標的である正規産物の増幅効率が副産物生成に影響を受けたとしても基本的には問題にならないという点で、優れていると考えました。 そのかわりにデジタルPCRはリアルタイムPCRより検出のレンジは下がるのでしょうけれど。

お礼 削除/引用 No.999-11 - 2012/10/15 (月) 14:19:17 - ナルナ 書き込みのお礼が遅くなりすいません。 ここでなされている議論を見て、かなり勉強になしました。

(無題) 削除/引用 No.999-10 - 2012/10/14 (日) 12:58:40 - KEN ＞ふみさん 増幅曲線に変な変曲点というのは、サイクル数が高いところでカクってなっているやつですよね？（説明がものすごく下手ですみません） 以前、私も経験したことがあり、アフ◯ライドバイオシステムズの技術に問い合わせたことがあります。 RAWデータで見たら早い話だったのですが、私の場合は蛍光値の振り切れでした。プローブ濃度を少し下げるとうまく行きました。 アフ◯ライドバイオシステムズによれば、振りきれる前までのデータは正確とのことです。 サイクル数にもよるのですが、高サイクル数で、ネガティブコントロールでTaqにより加水分解が起きて、バックが高くなることはあります。 まあ、やっても45サイクルは超えるのはやめたほうがよいでしょう。 検量線は低濃度域まで同じ傾きか？との件に関してですが、希釈液には何を使っていますか？水やTEを使うと、チューブへ吸着したりし、ばらつきが大きくなります。 私は、タカラハ''イオのEASY Dilutionを使っています。 私も低コピーターゲットの解析を行うことが多いですが、普段よりはサンプル濃度を許容範囲内で高めに設定し解析したり、逆転写時に、1step法を用いて検出するようにしています。（感度が上がりますし、コンタミのリスクも減りますから） 絶対にプライマーダイマーが出来ない方法（たとえば、出来る横から分解されていくとか）が出来ればいい気がしますけどね。SYBRだと32-35サイクルを超えての立ち上がりはほとんどの場合、プライマーダイマーですからね。

(無題) 削除/引用 No.999-9 - 2012/10/13 (土) 00:20:09 - ？ >ふみさんは書きました : > 低コピー数の標的にはデジタルPCRということに同意します。 素人なのでよくわからないのですが、Probe法に難色を示しているのにデジタルPCRを肯定するのはどういうこと？

追伸 削除/引用 No.999-8 - 2012/10/12 (金) 21:37:12 - ふみ 複数標的のreal time PCRをする際には、SYBR Greenより高濃度にできる新世代の蛍光インターカレータを用いる。 望ましくは、その複数標的分は同じランで検量線のデータを得る。 というやり方で信頼性をあげられると思います。 低コピー数の標的にはデジタルPCRということに同意します。

Probe法のreal time PCRでは産物のゲル泳動をしない？ 削除/引用 No.999-7 - 2012/10/12 (金) 21:27:03 - ふみ サイクル数を増やせば確かに副産物が増えてきやすいです。 それは、SYBR Green法とProbe法で共通の現象ですよね。 Probe法ではreal time PCR装置でシグナルとして見えているのが副産物を除いた標的産物だけだとしても、(シグナルとして検出されない)副産物ができていればその副産物の影響を標的の増幅効率が受けるのではないでしょうか。 サイクル数を増やさないと検出できないようreal time PCRをProbe法でやっているときに、増幅曲線に変な変曲点があったりしないですか？また、検量線は低濃度域まで同じ傾きですか？

(無題) 削除/引用 No.999-6 - 2012/10/12 (金) 20:47:39 - KEN ミス　MBG→MGBプローブ 失礼しました。

(無題) 削除/引用 No.999-5 - 2012/10/12 (金) 20:45:43 - KEN SYBR法ですと、プライマーダイマーに悩まされることが多いですね。 他の方がおっしゃるように、コピー数が多いターゲットではSYBR法でも問題ないのですが、コピー数が少ないターゲットですと、サイクル数が増えれば増えるほど、プライマーダイマーも出現する可能性は高くなります。 また、厳密な研究には向かないのかもしれませんが、マルチプレックスで一度に複数のターゲットを調べたい場合は、プローブ法でないと不可能です。 SYBR法を私も使いますが、リアルタイムを行い融解曲線分析して、あちゃーーーなんてことはよく経験しますし、論文でも、Ct◯以降は非特異としたという記載が見られるSYBR法を用いた論文をよくみかける気がします。 合成コストに関しては、結構、安いのもあります。少量であれば、1万円程度で入手可能です。(MBGプローブ等を設計してもらうとなると高いですけど。。。) 設計していざ試して失敗ということになると、非常にイラっとしますので、R◯cheのようなUniversal Probe Libraryを使うというのもひとつの手です。私の大学は、共同購入で小分けにして数千円で売ってもらえます。 最後に個人的には、これからは低コピーのターゲットに関してはデジタルPCRに変わっていくのではないかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.999-4 - 2012/10/09 (火) 10:31:53 - ンンノ 経験的なところでいうと信頼限界を比較すると、反応系の中に投入した被験試料 中に含まれる鋳型となる配列を持つ分子の数で、SYBR法の１００コピー程度な のに対してProbe法だと１０コピーくらいです。 現実的に、コピー数の非常に少ないターゲットだとProbe法でしか検出できない ことがあります。Probe法で検出できなかったからといってゼロであることを 証明できるわけではないですが、そういうものをそういうレベルで議論する 必要がある時には有用なシステムです。

それは欠点なのか？ 削除/引用 No.999-3 - 2012/10/09 (火) 09:23:00 - ふみ 意図せざる産物を含めてシグナルとして検出することは欠点ではない場合が多いように私には思われます。 PCR産物を全部検出できる系であるSYBR Green法は、目的のものだけが増えていることを確認してから標的分子の濃度を算出するという点で、優れた方法だと思います。 対して、Probe法ではprobeが検出しない副産物をプライマーが増やしているかどうか直接は分かりません。非特異産物は、プライマーのアニーリング温度が低くて確率的にしか増えない場合もあり、サンプルによってできたりできなかったりすることもしばしば経験することです。もちろんProbe法を適用することで上手くいく場合があるのは同意しますが、コストは高いがSYBR Green法より優れた方法だとProbe法のことを評価するのはちょっと違うように感じています。

(無題) 削除/引用 No.999-2 - 2012/10/08 (月) 13:11:11 - 研究費には限りがある SYBR Green法の欠点として、 プライマーダイマーでも、非特異的PCR産物でも ２本鎖ＤＮＡならすべてひっくるめて、 シグナルとして検出してしまうので、 目的の遺伝子特異的で、なおかつ増幅効率も良い プライマーペアを設計するのが、 遺伝子によっては難しい事もある。 要は、費用 対 効果 です。

リアルタイムPCR 削除/引用 No.999-1 - 2012/10/07 (日) 09:29:35 - ナルナ リアルタイムPCR法に関して質問です。 よく使う、SYBR Greenをつかって任意のプライマーでPCRをしながらその蛍光強度を計測し、その結果からDNA濃度を、絶対数としてまたは相対値として計算する方法があります。 これと比較して、計測目的配列のプローブを作成して計測するDual-labeled Probe法がもつ利点というのはどのようなものがあるのでしょうか？ プライマー変えればどんな配列でも計測できる上記の方法と比較して、どの様な点が有利なんでしょうか。 プローブ合成してもらう以上、コストが高くなると思うんですが。 どなたかご存知の方、お教えください。

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