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(無題) 削除/引用 No.1196-2 - 2012/11/27 (火) 22:21:06 - たまに 私なら、1プレートを３分割して（しなくてもよい）、それぞれのコロニーをプレートに広げます。１夜培養して、かきとって、ミニプレップでプラスミドの状態がどうなるかを見ます。液体培養でだけ増えないというのはたまに聞きますね。

大腸菌が液体培養で増えません。 削除/引用 No.1196-1 - 2012/11/27 (火) 21:09:25 - 自信なし いつも拝見させていただき、勉強しております。 非常に幼稚な質問でよくある内容かとは思いますが、いくつか別法を試してみても上手くいかなかったので質問させてください。 当方、興味ある遺伝子AをTOPOベクターにクローニングし、配列はsequencingにより確認しました。 insert入りのTOPOベクターとレトロウイルスベクターそれぞれを、EcoR1(NEB) / Not1(TOYOBO)（NEB buffer 3+BSA）で２時間酵素処理後、電気泳動を行い、目的のバンドの切り出しを行いました。 TAKARA ver 1.2のligation kitにより、Vectorを0.008 pmol使用し、Vector:insert＝1:10の質量比で３時間, 16°Cでligationを行い、DH5αに形質転換して、その後はLB/Amp100 plateに播種しました。 insertを入れなかったプレートからは大腸菌は20個程度しか生えず、insertを入れたプレートからは10E4ほどのコロニーが出ました。（これもちょっといつもに比べて異常に多い気がします。。） そのうちの６つと、insertを入れなかったプレートから生えた２つのコロニーをピックしてLA100の液体培地2 mlで培養しました。 しかし、２つのコロニーからは元気な大腸菌が増殖するのに対して、６つのコロニーいずれも増えてきません。 過去のトピックを拝見し、Stbl3を使用して、32°Cでも培養してみましたが駄目でした。 コロニーPCRはしていません。次回はするつもりです。 やはりレトロウイルスベクターのLTR間の組替えが問題になっているのでしょうか。。？ すみませんがアドバイス、よろしくお願いします。

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