BioTechnicalフォーラム [24wellからのTrizol抽出で純度・収量を伴に上げたい]

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No.1397-8 - 2013/01/31 (木) 07:35:19 - KEN

一応、TRIZOLの自作プロトコール

http://www.my-whiteboard.com/homemade-trizol-protocol-for-isolating-rna-from-culture-cells/

ただでさえ、抽出が失敗している現状で、自作TRIZOLを使うのはやめたほうがいいでしょうけど。ｗｗｗ

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No.1397-7 - 2013/01/31 (木) 07:14:54 - おお

えっとTRIZOLあるいはそれとほぼ同等の試薬を自前で調せいするというのもてかもしれませんよ。コストの計算はした事ありませんけど。

安くつくなら6ウェル使わしてくれるというロジックが成り立つなら。。。

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No.1397-6 - 2013/01/31 (木) 07:11:01 - おお

>[Re:5] KENさんは書きました :

> >>おおさん
> 収量よりクオリティーとのご意見ですが、
> 予備実験で、インターナルコントロールのRT-PCRでA260/280が1.9、出来れば1.95以上絶対必要って、なんだか条件が厳しすぎる気がしませんか？
> 経験則的には、当方では、1.8くらいでも十分行けることが多いですが。。。

1.7でも十分かもですね。OD比は目安ですし、TEにするのか水で測るのかでも変わってきますし、RNAのばあいは特に酸性に傾いていて低めに出ることも意識してなければあると思いますし。TRIZOLならフェノールキャリーオーバーで高く見積もられるかもしれませんし、なので比で見れるクオリティー以外のところもあると思いますし。

クオリティーとかいたもう一つの理由は分解の可能性も考慮に入れてほしいということも考えてのことでした。

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No.1397-5 - 2013/01/31 (木) 06:47:29 - KEN

>実験対象細胞(NIH3T3)からはどうしても高純度で取れません

ちなみに、nano dropで見た時の波形とA260/280はどの程度でしたか？

>>おおさん
収量よりクオリティーとのご意見ですが、
予備実験で、インターナルコントロールのRT-PCRでA260/280が1.9、出来れば1.95以上絶対必要って、なんだか条件が厳しすぎる気がしませんか？
経験則的には、当方では、1.8くらいでも十分行けることが多いですが。。。

(無題)

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No.1397-4 - 2013/01/31 (木) 05:41:19 - おお

収量よりクオリティーが必要なのではとおもいます。100ngもあればRTPCRはできますし。どうしても24ウェルにこだわるなら、2ウェル同じ処理したものを合わせて、精製します?

わたしがよくやっていた方法はTRIZOLでクロロフォルムをいれたあとの水相をほぼ全部とって、次にフェノール(TRIZOLでもいいです)を加えて(ボリュームの1/5程度)、確かさらにクロロフォルムも加える必要があると思いましたが、それでもう一度水相と有機相をわけると、沈殿した中間層が少なくまたエッペンそ先細りしているところで2相の境界があるので少ない容量で中間層との物理的距離が稼げるので80%ぐらい水相を回収できます。気になるならもう一度水相を全部回収してもう一度フェノールを加えてもいいかもしれませんが、全部取るといってもやはり少しは水相は残ると思いますので、収量にどの程度影響するかという点でどうするか決めないと行けない点かもしれませんん。

さらにそれでもふあんなら得られた水相に同量の飽和尿素を加え酢酸ナトリウム添加後えたチンする事もありましたが、これは一般に樹立している方法ではないので責任はもてません。

収量はともかくほかの細胞でちゃんとしているRNAが取れているなら、よほど特殊な細胞でない取れるはずです。それを確実に把握するには実際にエイどうパターンを見る必要がありますけど。

またグリコーゲンなどをつかってえたチンできないRNAは(あなたの扱っている範疇では)ないと思います。

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No.1397-3 - 2013/01/31 (木) 05:05:46 - KEN

私も、RNA抽出を1年半させられて失敗し続けるというのは、ちょっと気の毒としか。。。
1年半もあれば、論文1本くらいは書けますからねえ。。。

1ugとれていたら、十分かと思いますが、そんだけ失敗していると、純度をバイオアナライザで確認したいですね。
また、増幅効率が悪いとなると、プライマーの設計や分解も心配ですね。
酵素は何を使っていますか？失礼なこと申し上げてしまいますが、節約し過ぎて、かなり粗悪な酵素使っていたりする予感も。。。
あとは、RT-PCRをOne stepで試してみてはどうでしょうか？
RTのプライマーを変えるだけですし、許可はいらないのでは？

24ウェルなら行けそうな気もしますが、上記を行なってもダメだったら最終手段は、抽出せずにそのまま細胞からダイレクトRT-PCRかけてみてもいいかもしれませんね。(節約ラボっぽいので、許可が降りないかもしれませんけど。。。)

>ペレット消失の頻度が多い
先生が仰るように手技の問題というならば、あんまり完全に吸い取ろうと思わないのがコツかと。
また、ペレットの目視ということでしたら、ニッポンジーンのエタ沈メイトとかTAKARAのGenとるくんを使われてはいかがですか？

Genとるくんの方が、グリコーゲン共沈よりも回収できるかと思います。

>注射器を通すゲノムDNA細断作業
これは、おっしゃるとおり、あまり意味が無いかと。ピペットだけで十分かと思います。

あと、手技の問題ということならば、カラム抽出という手も。試薬メーカーにメールかFAXすれば、無料でサンプルを貰えるところが多いので、試してみてはいかがでしょうか。

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No.1397-2 - 2013/01/31 (木) 03:17:51 - KY

うーん。
いろいろとその先生の言動とか一年も失敗を続けている事とか、ツッコミどころはたくさんあるのですが、真面目に答えると。
真面目に答えようと思ったけど、内容に具体性がないため、いまいち何を行っているのかわかりません。
最終的なアウトプットは逆転写PCR後に目的産物がPCRで増加するかどうかということですよね。
具体的な答えを求める場合は、具体的にどのような試薬をどのくらいの温度でどのくらいの時間おこなっているとか、具体的な情報がないと答えようがありません。

>この細胞では水層を取る量をTrizolの30%以下にして、純度を上げ、ギリギリ1ug程度取って来れるのですが、以前の実験対象細胞(NIH3T3)からはどうしても高純度で取れません。
このくだりの文章ですが、ここでいう高純度というのはどのようにして計ってのでしょうか？

1ugが必要なのでしょうか？RT-PCRであれば0.5ugぐらいでも十分できると思いますが。
プライマーの善し悪しはかなり再現を取るために重要だと思いますが、使用しているプライマーなどは増幅効率などが十分にあることをすでに確かめられているということでよろしいでしょうか？

内容的に、節約しているラボのようなのですが、同じ失敗を繰り返すほうがコストも時間も余計にかかります。6well dishにするだけで解決するのであれば、それで良いとは思いますし。それでもその先生が24wellでやれといっているのはよいとしても、24wellでなぜ失敗しているのかその原因を全く手助けしないのは（腕の問題だと言っているのでしょうかね）、教える立場としては偏屈者であり、非論理的な研究者ですね。まぁ、そんなラボに入ってしまったあなたの運が悪いとしかここでは言いようがないです。

24wellからのTrizol抽出で純度・収量を伴に上げたい

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No.1397-1 - 2013/01/31 (木) 00:08:39 - trizol

初めまして。お世話になります。タイトルの通りです。
「培養液・Trizol試薬の量をできるだけ少なく済ませたいし、24wellで培地面積量に準じてTrizol使って充分取れるから」との先生からの指示で24well培養細胞からのRNA抽出を行っています。
が、自分が下手なため、この1年半ろくに取れません。6wellDishに変えたい旨は伝えましたが24wellで頑張ってくださいとのことでした。1年経った時点で研究室の細胞が形質転換してしまったのではないかと、対象細胞を何度か変え、実験対象じゃない細胞からは上手く取れてきたのですが、その上手く行った結果から、自分が欲しいPCR産物はA260/280>1.9(できれば1.95)じゃないとPCR結果が不安定になることが判明しました(n=5)。この細胞では水層を取る量をTrizolの30%以下にして、純度を上げ、ギリギリ1ug程度取って来れるのですが、以前の実験対象細胞(NIH3T3)からはどうしても高純度で取れません。注射器を通すゲノムDNA細断作業はあまり効果がありませんでしたのでPCRの不安定性は別のところにあるのかもしれません。Trizol２週目(結果的にTrizolケチれてないかもしれませんが)を試しても、収量の低下、ペレット消失の頻度が多いです。
ちなみにこの細胞から安定的にポジコンが取ってこれるようになった後、一過性発現で遺伝子導入、サンプル取り、ということをしなければなりません（幸いNIHは導入効率はいいのですが不安です）。
あと、グリコーゲン共沈ではRNAしか沈まないのでしょうか？グリコーゲン共沈ではグリコーゲン最低量でもペレットが目視しやすく純度もある程度までは改善されるのですが目的遺伝子のPCR結果は今のところ芳しくありません。この点も疑問に思っています。

もし先輩方で「俺はこうやっている」とか「こうすればいいのではないか」と考えられるものがあれば教えてください。
ちなみに過去ログには「24well数個分を1サンプルとする」という書き込みがあったのですがこれは最後の手段にしたいと思います。

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