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(無題) 削除/引用 No.1405-5 - 2013/02/01 (金) 22:33:41 - 直輝 追記します。 ＞ある人の方法だと、各wellへのピペッティングが2回になり、各well間の誤差がより大きくなるではないか、と主張したところ、 それが本当の誤差なのだ。ピペッティングを1回にするのなら3wellとも全く同じ内容になるのだから（実際は必ず結果に誤差が出てきますが）、そもそもtriplicateをする必要はない、と反論されました。 その人の反論のとおりだと思います。 みみさんのやり方だと、triplicateには#3で生じた誤差しか反映されていませんよね。でも、#1や#2の時にも誤差は発生しているわけです。triplicateの誤差が小さいのは、最後に３つに分注した誤差しか見ていないからであって、#1や#2のときに誤差がなかった訳ではありません。 後者のやり方だと、triplicateは#2と#3の誤差を反映しているので、少し広い範囲の誤差を見ることができます。

(無題) 削除/引用 No.1405-4 - 2013/02/01 (金) 22:00:51 - 直輝 別にどっちでもいいと思うよ。 でも、ある人が言ったやり方が普通でしょう。（私も後者のやり方です） 理由はcDNA入りのマスターミックスを作ると、サンプルの数だけマスターミックスを作ることになり、チューブが増えて面倒臭いから。 みみさんの方法に比べれば、Triplicateの誤差が多少増えるのかもしれないけど、特に問題は感じていないです。 Applied Biosystemsのreal-time PCRの講習も受けたこともありますが、やはり後者のやり方で教えられました。

(無題) 削除/引用 No.1405-2 - 2013/02/01 (金) 19:53:24 - KY > > プライマーではなく、cDNAを含むマスターミックス1を調整する理由ですが、リアルタイムPCRの場合、最後にGAPDH等のインターナルコントロールでノーマライズするためには、A、B、C、GAPDHのPCR溶液それぞれに含まれるcDNAの量ができるだけ等しくなければならないと考えるからです。逆に、プライマーの量は若干誤差が出たとしても、cDNAに対して元々十分量添加されているはずなので、結果に差が出にくいと判断しました。 私はあなたと同じ方法で行っております。理由は同じです。

リアルタイムPCR用マスターミックスの調整の仕方 削除/引用 No.1405-1 - 2013/02/01 (金) 18:16:18 - みみ タイトルの内容について質問させて下さい。 私は通常、リアルタイムPCRのマスターミックスを調整する際、全ての内容物を含んだマスターミックスを作成して、それを分注しています。 具体的に述べますと。例えば、technical replicatesをtriplicateにした場合ですが、 #1:まず、SYBR-green+水+cDNAのマスターミックス1を調整します。 #2:次に、マスターミックス1を使用するプライマー数だけ分注します。使用するプライマーが4種類（A、B、C、GAPDH）なら、4つに分注して、それぞれにプライマーを加えます。これをマスターミックス2とします。 #3:最後に、4つのマスターミックス2をそれぞれ(triplicateなので)3つのwellに分注し、リアルタイムPCRマシーンにかけます。 プライマーではなく、cDNAを含むマスターミックス1を調整する理由ですが、リアルタイムPCRの場合、最後にGAPDH等のインターナルコントロールでノーマライズするためには、A、B、C、GAPDHのPCR溶液それぞれに含まれるcDNAの量ができるだけ等しくなければならないと考えるからです。逆に、プライマーの量は若干誤差が出たとしても、cDNAに対して元々十分量添加されているはずなので、結果に差が出にくいと判断しました。 しかし、ここである人にこう言われました。 普通は、 #1:まず、SYBR-green+水＋プライマーのマスターミックス1を調整します。使用するプライマーが4種類なら、4つ。 #2:そのマスターミックス1を(triplicateなので)3つのwellに分注します。 #3:最後に、その上から、cDNAを3つのwellに一発ずつ足していき、リアルタイムPCRマシーンにかけます。 だよ、と。 両者の違いは、 1、私がcDNAのマスターミックス1を調整するのに対し、ある人はプライマーのマスターミックス1を調整する。 2、私がマスターミックス2を調整し、各wellへのピペッティングを1回で済ますのに対し、ある人はマスターミックス2はスキップしてwellに分注してしまう。そしてその結果、cDNAを追加で1wellずつ足して行く。 の2点です。 ある人の方法だと、各wellへのピペッティングが2回になり、各well間の誤差がより大きくなるではないか、と主張したところ、 それが本当の誤差なのだ。ピペッティングを1回にするのなら3wellとも全く同じ内容になるのだから（実際は必ず結果に誤差が出てきますが）、そもそもtriplicateをする必要はない、と反論されました。 確かに、オンラインでプロトコルを検索すると、ある人の調整法ばかりがヒットしてきました。 私の調整法には、なにか問題があるでしょうか？それとも、どちらの調整法でも、問題はないのでしょうか？ リアルタイムPCRに詳しい方、ご存じの方、御教授よろしくお願いいたします。

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