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(無題) 削除/引用 No.1537-24 - 2013/03/25 (月) 16:10:30 - AP >ありゃさんとAPさんで、forward(とreverse）の意味を逆に捉えているのだと思います。 実際にそういう事なのかどうかは置いておいて、 形容詞と副詞の違いというわけではないですね。もちろんforward primerのforwardですからここでは形容詞です。 形容詞としても、 1) 前向きの、前方に向かった、順行の 2) 前方の、前に位置した という二通りの意味があります。 しかし、forwardとreverse(d)と対で使っているのですから、意味の取り違えようはないでしょう。 (1)の意味の対義語はbackwardやreverse(d)ですが、 (2)の意味の対義語は、backやposteriorのはずですから。サッカーのポジションだってフォワードに対してはバックですね。

(無題) 削除/引用 No.1537-23 - 2013/03/25 (月) 13:06:08 - mon ありゃさんとAPさんで、forward(とreverse）の意味を逆に捉えているのだと思います。 「前方の（形容詞）」「前方へ（副詞）」と捉えるかで向きが逆ですから。 ものの本をみててアレ？と思ったことがあります。両方共見たことあるけど、どっちの意味が本筋なんだろ？ 私自身は、APさんと同じ向きで使いますけど。

(無題) 削除/引用 No.1537-22 - 2013/03/25 (月) 12:53:49 - AP >APさんの方法では、できないと思うのは当方だけでしょうか。 joining PCRあるいはoverlap extension PCRという手法を理解している上で、戦略上の不備があるとおっしゃるのでしょうか。ならば、どの点でしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1537-21 - 2013/03/25 (月) 02:46:44 - おお ttp://openwetware.org/wiki/PCR_Overlap_Extension ttp://www.springerimages.com/Images/LifeSciences/1-10.1007_978-1-60327-084-7_12-1

(無題) 削除/引用 No.1537-20 - 2013/03/24 (日) 23:34:53 - ありゃ 残念ながら、できないと予想した通りだったようですね。 図をかいて考え直しましょう。

(無題) 削除/引用 No.1537-19 - 2013/03/17 (日) 05:40:11 - おお わたしならアニーリングの時間をながくするかなぁ。。。と思ってみたりしてます。30s以上とか。 あとやれそうなことは片側のプライマーとそのテンプレートだけでPCRしてとにかく1本鎖を増幅してから両者を混ぜるとお互い相補さがない状態なので、希望するアニーリングがおこりやすいだろうなぁとおもいました。まあさいしょから両者まぜていても同じ状態をつくれるんですが複数のプライまーとテンプレートからくるのんすぺをへらせるかもしれませんので、、、

(無題) 削除/引用 No.1537-18 - 2013/03/15 (金) 10:10:21 - mon 以下のようにPCR cycleはいかがでしょうか。 スメアーになるようでしたらPrimer濃度は低め(0.1uM)にして 98℃　10sec 68℃　5sec (-1℃/cycle) 68℃　2min yy cycle (Overlap部分のTmまでannealing温度が下がるcycle数） 98℃　10sec zz℃　5sec (primerに合わせる) 68℃　2min x10-20 cycle

(無題) 削除/引用 No.1537-16 - 2013/03/14 (木) 17:01:39 - 774 プライマー次第ですが、後半の２５サイクルのアニールをもっと上げてもいいかと思います。 A、Bの単独増幅はプライマーのコンタミが原因かもしれませんね。 スメアになってるのはtemplate過剰の感じがあります。 もっと減らせば抑えられるかもしれません。 （これも断片のサイズ次第ですが。）

(無題) 削除/引用 No.1537-15 - 2013/03/14 (木) 13:55:44 - 学生 ＰＣＲ後ゲル切りだし、精製したＡ（ＡF＋オーバーラップ部分産物）とＢ（ＢR＋オーバーラップ産物）のフラグメントをテンプレートとしてそれぞれ２０ngずつ入れました。 酵素はPrimeSTAR ® HS DNA Polymeraseで 98℃　10sec 53℃　5sec 68℃　2min プライマーなしで１０サイクル、 プライマーAFとBRを入れて２５サイクル。 ＡのテンプレートとＢのテンプレートの位置にバンドが二つ出て、全体的にノンスペかスメアになっていました。 目的の位置にうっすらありましたが、これはノンスペでした。 molecular cloningの項目を見てみます。何かいけなかったのかもしれません。 ありがとうございます。 Tmは53℃と設定したのですが、もう少し上げた方がよかったでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1537-14 - 2013/03/14 (木) 13:32:42 - AP >ＰＣＲなので改善が難しいかと思います。 そんなこともないと思いますが、もしよかったら、念の為にどんなふうにやったか詳細を教えてもらえませんか。特に、A、BそれぞれのPCR産物を得てから先のことを。 やり方を少し変えてみるなら、話題にもなったように、PCR産物AとBを混ぜてからプライマーなしで数サイクル反応させてから、プライマーを加えてPCRをするというのを試してみるのもいいでしょう。 手技としてはそれほど難しくなく、Molecular Cloningが手元にあれば、PCRによるmutagenesisの項にプロトコールがありますし、一般的には、overlap extension PCRとかjoining PCRという名称で広く流布している方法ですので、容易にいろいろな出元のプロトコールが見つかると思います。

ノンスペでした・・・ 削除/引用 No.1537-13 - 2013/03/14 (木) 10:04:38 - 学生 皆様お世話になっております。 だめでした・・・目的の位置に見えたものはノンスペでした。 私の手技が下手なのかもしれませんが、ＰＣＲなので改善が難しいかと思います。ライゲーションのほうを試してみて、それでも駄目ならオーバーラップ部分をもっと延長して再度チャレンジしてみようと思います。 オーバーラップ部分は１５ｂｐでした。

(無題) 削除/引用 No.1537-12 - 2013/03/13 (水) 17:03:51 - 774 オーバラップの長さでノンスペの数が変わったことがあります。 経験的には通常15bp、最低12bpだったような気がします。 （もうちょっと短くてもいけるかもしれません。）

(無題) 削除/引用 No.1537-11 - 2013/03/13 (水) 15:17:18 - 学生 ＡＰさんの方法でやってみました。 ノンスペがかなり多く出たのですが、うっすら目的の位置に何かが見えました。 これがノンスペなのか、そうではないのか確かめてみようと思います。 できていたら報告にまいります。

大変勉強になりました 削除/引用 No.1537-10 - 2013/03/13 (水) 09:37:03 - 学生 どうもありがとうございます。 では皆さんのご意見をもとに早速今からやってみようと思います、できましたら報告しに参ります。

(無題) 削除/引用 No.1537-9 - 2013/03/13 (水) 01:15:48 - おお まあどんな場合もうまくいくかというとそうでもないとおもえますのでplan Bを用意しておくのがいいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.1537-8 - 2013/03/13 (水) 01:13:37 - おお 末端にオーバーラップがあれば、皆さんが書いているようにつなげるプロとコールがつかわれることがあります。 オーバーラップする部分のプライまーを微量いれたじょうたいで、期待するフラグメントの両端のプライまーを通常どおりにいれて1ステップでやったりする事もあるようですが、テンプレートなどによっても難易度がかわるとおもいます。 昔はクレノーを使ったりして、重複する部分から伸ばしていったりもしたようです。

(無題) 削除/引用 No.1537-7 - 2013/03/12 (火) 23:20:08 - 直輝 あ、そうだったんですね！ ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1537-6 - 2013/03/12 (火) 22:50:26 - AP >(4) (3)で精製したPCR産物を混合して、Primerなしで数サイクルPCR >※DNA断片がお互いにプライマーになってつながる。 これは古いプロトコールでは定番だったんですが、最近では（酵素の性能が良くなったせいか）、やらないとするほうが普通になってきてると思います。。

(無題) 削除/引用 No.1537-5 - 2013/03/12 (火) 22:31:28 - KEN Ligationしたほうがよくないですかね？

(無題) 削除/引用 No.1537-4 - 2013/03/12 (火) 22:29:24 - 直輝 APさんので合っていると思うけど、プライマーなしのPCRを挟んだ方がベターかもしれない。 (1)テンプレート：Ａ、プライマー：AfおよびA-Br、でPCR (2)テンプレート：Ｂ、プライマー：A-BfおよびBr、でPCR (3) (1)(2)のPCR産物をゲル切り出しで精製 (4) (3)で精製したPCR産物を混合して、Primerなしで数サイクルPCR ※DNA断片がお互いにプライマーになってつながる。 (5)プライマー：AfおよびBrを追加してPCR

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