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(無題) 削除/引用 No.2078-29 - 2013/06/11 (火) 08:36:42 - ぽにょ tttさん 情報をありがとうございます。次の商品ですね。購入して切り出しの際にのみ用いることにします。もしもっと安くて良い商品を御存じでしたら教えてください。 GelStar® 核酸ゲル染色 Lonza 50535 2×250 µl 30,000円 http://www.lonzabio.jp/page/electrophoresis_and_analysis026/

(無題) 削除/引用 No.2078-28 - 2013/06/11 (火) 08:26:53 - ぽにょ APさん 次の御意見について、確認させてください。 ”EcoRIとKpnIとM buffer、は感心しない。こういう場合、順次消化が基本。つまり低塩濃度→高塩濃度と順次消化するか、エタノール沈殿を挟んでバッファ交換をするのが第一選択。” エタノール沈殿は省略したいです。そのため、次のような順番で良いでしょうか？ 増幅産物のEcoRIとKpnI切断の場合 1ul KpnI 1ul 10x Ｌ buffer 1ul DNA溶液(例　0.5　ug/ul) 　7ul water mess upto 10ul 　 37℃、１時間 　1ul EcoRI 　2ul 10x H buffer 　7ul Water to make 20ul 　 37℃、１時間 ベクターのEcoRIとKpnI切断の場合 　1ul KpnI 　1ul 10x Ｌ buffer 　1ulプラスミド溶液(例　1ug/ul) 　7ul water mess upto 10ul 　 37℃、１時間 2ul Alkaline Phosphatase 1ul EcoRI 2ul 10x H buffer 5ul Water to make 20ul 　 37℃、１時間 またEcoRIの段階では、オーバーナイトの方が良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2078-27 - 2013/06/11 (火) 06:22:40 - ttt わたしが使ってるエチブロの代替品はLonzaのGelStarです。 　 ちなみに、わたしは65℃5分でheat inactivate出来るフォスファターゼを使ってますが（他の人と共用してるので）、Vectorもカラムでゲル抽出しています。カラムでやる場合は1つくらい増えても手間も時間も変わらないし、より確実で、失敗した場合に考慮する要素も少なくて済みますので。

(無題) 削除/引用 No.2078-26 - 2013/06/10 (月) 23:32:50 - AP >うかつながら、アルフォスと制限酵素入りのままで、しかも95℃で5分の熱処理なしで、ligase反応をしてしまいました。 おいおい。少なくとも説明書通り忠実にやってからにしてほしいなあ。 ところで、95℃で5分なんでDNAが解離変性しないのかなあ。 昔ながらの方法でフェノール抽出で精製したほうが無難だと思う。

(無題) 削除/引用 No.2078-25 - 2013/06/10 (月) 23:15:41 - ぽにょ 訂正です： 誤：青白コロニーはできなくて当たり前でした 正：青コロニーはできなくて当たり前でした

(無題) 削除/引用 No.2078-24 - 2013/06/10 (月) 23:14:34 - ぽにょ 重ねて、皆様のアドバイス、誠にありがとうございます。 制限酵素サイトの外に3塩基ほどの足場はつけてあります。またベクターには既に別のインサートが入っているので、よく考えたら、青白コロニーはできなくて当たり前でした。 qqさんのおっしゃるとおりに、うかつながら、アルフォスと制限酵素入りのままで、しかも95℃で5分の熱処理なしで、ligase反応をしてしまいました。ライゲーションバッファ中で、しかも１６℃ではアルフォスと制限酵素が働かないだろうと考えてしましました。重要な改善すべきポイントです。 なおアルフォス無しのベクター切断の場合、一つの制限酵素だけで切れてつながり直したベクターがとれてきそうなので、アルフォスは引き続き使用しようと考えています。 PCR後には、プライマーダイマーのバンドがアガロースゲル泳動の段階で認められています。そのため、切り出しと精製をしましたが、ｃDNAさんの御意見のように、アガロースゲル泳動無しですませてみようと考えています。 tttさん、お使いの、エチブロの代替品の良い螢光試薬の名前と会社名を教えてください。 APさん、切り出したゲルをそのまま、あるいは凍結融解して凍り豆腐にして、高速遠心してでてきた液（in TAE）をライゲーションすることも検討してみます。またシングルカットを繰り返すことにします。 AAさん、各ステップのあとで一部を泳動してきちんととれているかとおよその濃度を調べることにいたします。

(無題) 削除/引用 No.2078-23 - 2013/06/10 (月) 22:40:31 - ttt ちなみに、個人的な印象では、Washの回数を2回よりも増やすことにあまり意味は無いような気がします。ゲル溶解液も含めて、1回毎の遠心の時間を伸ばして残留液を最小限にすることの方が大事かと

(無題) 削除/引用 No.2078-22 - 2013/06/10 (月) 22:28:43 - ttt qqさんの意見はありそうですね。 お使いのフォスファターゼはheat inactivate出来るタイプのようですが95℃で5分の加熱を必要とするようです。この処理は行われたのでしょうか？ ただ、その場合でもEcoRIはNEBのサイトによるとheat-inactivateできますが、KpnIは出来ないようなのでそっちの方も心配する必要ありそうですが。

(無題) 削除/引用 No.2078-21 - 2013/06/10 (月) 22:09:14 - AP >EcoRIとKpnIとM buffer、 これは感心しない。EcoR1は塩濃度が低いとスター活性が出やすいし、Kpn1は塩が入ると格段に切れなくなる。メーカの資料などに至適バッファの異なる酵素で二重消化するときはこのバッファみたいなことが書いてあるが信用してはいけない（もしそれで問題がないのであれば、バッファ種類はあんなに必要ないではないか）。こういう場合、順次消化が基本。つまり低塩濃度→高塩濃度と順次消化するか、エタノール沈殿を挟んでバッファ交換をするのが第一選択。妥協的なバッファで同時消化するのは、少々、消化に難があっても構わない目的（プラスミドのスクリーニングで消化パターンを比較するときなど）のときと心得るべし。 ところで、プライマーの5'末端の制限酵素消化配列の外側に十分な足場（余剰の塩基）は付いているだろうか。 制限酵素処理済みのインサートのみをライゲーションしたとき重合が観察されるだろうか（制限酵素が効いていないと重合は起こらない）。 >。なおゲルはタカラバイオのSeakemGTGです。このゲルなら大丈夫でしょうか？ 昔から定評のあるメーカー（タカラは売っているだけでFMCですね）の高級ブランドです。お金持ちラボですね。

(無題) 削除/引用 No.2078-20 - 2013/06/10 (月) 21:28:10 - ｃDNA すみません、文字化けしてたのでもう一回 反応効率によりますが、反応液１uLで電気泳動で濃いバンドが見えるなら５−１０u;Lでも足りるでしょう。普段は２０uLを標準にしています。 薄い時は５０u;Lでやることもあるし、本当に増幅が悪かったり、スメアになるような感じの悪い時には５０uLｘ４本などもやります。

(無題) 削除/引用 No.2078-19 - 2013/06/10 (月) 21:25:45 - ｃDNA 長文書いてたらPCRの質問がありましたね。 反応効率によりますが、反応液１µLで電気泳動で濃いバンドが見えるなら５−１０µLでも足りるでしょう。普段は２０µLを標準にしています。 薄い時は５０µLでやることもあるし、本当に増幅が悪かったり、スメアになるような感じの悪い時には５０µLｘ４本などもやります。

(無題) 削除/引用 No.2078-18 - 2013/06/10 (月) 21:23:30 - AA 出だしのPCR反応液ですが、たいていの高正確性酵素の場合はマニュアルでは液量が50ulだと思いますのでその通りにやります。 大抵の場合はチューブ1本=50ulでうまくいきますが、PCR後の泳動でどうしても薄い場合は本数を増やして100、200ulと増やします。 私の場合の流れとしては、 PCR→MinElute→制限酵素(o/n)→泳動→QIAQuick Gel extruction kit→ →ligation convenience kit→transform です。 各ステップのあとでは一部を泳動してきちんととれているかとおよその濃度を調べます。 コンピは自作だったりHITだったりしますし、株もDH5alphaだったりJM109だったりします。

(無題) 削除/引用 No.2078-17 - 2013/06/10 (月) 21:21:48 - ｃDNA 私の説明が悪かったようですみません。 電気泳動は一回のつもりで書きました。 PCRの後、そのまま電気泳動、ゲル抽出にキットを使って、制限酵素処理の後は電気泳動なしにキットでクリーンアップという意味でした。 そもそも電気泳動を行っているのはPCR後に他のバンドが沢山あるからでしょうか？今の状況はコロニーが出ない様子なので、目的のバンドがメジャーバンドなら電気泳動を省くのも手です。ベクターもダブルカットなら脱リン酸化も省いた方が効率は上がるし、セルフライゲーションも大して起こらないでしょう。 よくある失敗はPCR産物の制限酵素サイトの外に3塩基ほどの余分な塩基を入れずに切れない、ということですが、大丈夫ですよね。 私はTakaraの酵素は普段使わないのですが、EcoRIは推奨バッファー以外でスター活性は問題ないですかね？確かにタカラのサイトのダブルカットではぽにょさんが使われているものが推奨されていますが、経験的には不安です。 未切断のベクターで無数の白コロニーということですが、これは青じゃなくていいのですか？今はコロニーが出ないのでそういう問題ではないですが。 既に指摘がありますように、未切断で数えきれないコロニーが出ても、同じ量のライゲーションしたベクターではコロニーが出なくてもそういうことは良くあります。 今のライゲーションのスケールで十分にコロニーが出る、という人は沢山いるでしょうが、出ないならその10倍、100倍でやったら？と思う人も多いかと。インサートをベクターの3倍、というのも定番ですがコロニーが出ないときは逆の比率でもベクターを増やした方がいい場合も良くあります。 16度2時間でうまく行くものも多いですが、ダメなら16度終夜にしたら、とも思います。 インサートも1kbならとにかく元の量を増やして精製後20ng/uLぐらいを調製するのは全然難しいことではないはずです。よっぼどPCRで増えにくいなら別ですが。 今の条件でうまく行ってもおかしくないですが、とにかく全部濃くしたら解決するような気がします。 ちなみにQIAEX IIはスピンカラムではないですよね？

(無題) 削除/引用 No.2078-16 - 2013/06/10 (月) 21:17:51 - qq ＞制限酵素で切って電気泳動を行っているのはインサート（約１kbp） ＞だけです。ベクター（約6kbp）の切断の際にはアルフォス と、いうことは、ホスファターゼと制限酵素入りのままでligase反応をしたのですね。 そうだとすると、 ホスファターゼは、インサートの末端リン酸を脱リン酸する可能性があります。 仮にligationが起きたとしても、その後で、制限酵素で再切断されるので、やはりその後脱リン酸されて、ligation不可能になります。 実験の詳細は、最初に出しましょうね。

(無題) 削除/引用 No.2078-15 - 2013/06/10 (月) 20:58:45 - ぽにょ すみません。もうひとつ初歩的な質問です。 PCRでインサートを調整する場合には、最初の出だしのPCR反応液量として、どのくらいからスタートするべきでしょうか？皆様はどのくらいから始めているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2078-14 - 2013/06/10 (月) 20:40:10 - ぽにょ 多くのアドバイスをいただき、誠にありがとうございます。 以下、補足をさせていただきます。 PCR反応後には、泳動と切り出しはしないで、キアゲン社のMinElute PCR Purification Kit (#28004）で精製して、制限酵素処理のための材料を調整しました。この後にナノドロップ測定をすべきだったと反省しています。 制限酵素で切って電気泳動を行っているのはインサート（約１kbp）だけです。ベクター（約6kbp）の切断の際にはアルフォス（Alkaline Phosphatase, Shewanella sp. SIB1, Recombinant <PAP> フナコシ DE110）を添加し、制限酵素と同時処理をしています。制限酵素はダブルカットです。全てタカラのものです。EcoRIとKpnIとM buffer、EcoRIとEcoRVと H buffer、EcoRIとNotIとH bufferとBSAの組み合わせです。 制限酵素反応液をTAEバッファでアガロースゲル泳動しました。切り出しゲルの精製は、QIAGEN　QIAEX II Gel Extraction Kit (#20021）を使いました。 推定する切り出しゲル中のDNA量が数百ナノグラムだと思います。５０％の精製効率だとして、溶出液量が20ulなので、なんとかギリギリ、ナノドロップで測れる濃度だと考えていました。 ただ、濃度を電気泳動で確認していなかったので、今後、確認することにします。 ライゲーション反応（タカラ6023　DNA Ligation Kit Mighty Mix）は、16℃２時間です。 HIT competent cellsのスーパーの25ulに、0.5ngの未切断ベクターをいれて、数え切れない程の白コロニーをえました。一方、切断ベクター３対インサート１の比率の混合液0.24ng（11ng/15ul ÷３）をいれてコロニーはゼロでした。 以下、質問をさせていただきます。 ｃDNAさんの、”PCRの副生成物を除くために電気泳動で分離してキットで精製してから制限酵素処理してクリーンアップ、の順番にすると、電気泳動に持って行けるサンプル量を増やしやすいと思います”という意味は、２回泳動をして切り出し、精製するという意味でしょうか？もしそうならロスが２重になりそうで、採用したくないです。 UV照射の時間は注意をしていますので、残留アガロース・残留溶解バッファー・残留エタノールが原因の可能性が高そうです。この対策は何か無いのでしょうか？洗浄バッファを自作して、荒いの数を増やして、エタノールとばす乾燥を長くすればよいのでしょうか？ GLサイエンス社製のものだと大丈夫なのでしょうか？具体的にはどの商品でしょうか？品番を教えてください。 ただMinElute PCR Purification Kitの段階でもロスが大きいような気がしています。 ただ、切り出したゲルをそのまま（あるいは凍結融解して）遠心ろ過したろ液（DNAが含まれる）をligation反応に持って行くことができるなら、そうしたいです。なおゲルはタカラバイオのSeakemGTGです。このゲルなら大丈夫でしょうか？ それから、次のアガラーゼ精製はどうなのでしょうか？ タカラバイオ 58001 F8001 β-Agarase 100 U ￥24,200 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003437 またPCR産物を制限酵素で切って、ベクターに組み込むよりも、TAクローニングをしてからの方がよいでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2078-13 - 2013/06/10 (月) 11:32:28 - 7744 > ところが、ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎて 既出ですが、これは普通だと思います。 キットのマニュアル通りやっているならおかしなことしていない限りたぶん大丈夫だと思う。 インサートの長さとかは？ 当然長いと入りにくいだろうし。 ものによってはいくらちゃんとやっても全く入らないこともありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2078-11 - 2013/06/10 (月) 01:37:49 - AP >ライゲーションして、コンピセルに入れ、青白コロニーをえるのが目的です。 これをやるのに失敗した原因が >ところが、ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎてうまくいきません。 このせいだという根拠はあるのだろうか。そうではない可能性が大きい。 ぶっちゃけ、切り出したゲルをそのまま（あるいは凍結融解して）遠心ろ過したろ液（DNAが含まれる）をligation反応に持って行ってもできるくらいの反応なのだが。ましてや、カラム系のキットを説明書通りに使って精製したなら、精製方法に問題があるとは思えない。 そりゃ大昔はアガロースの純度が低くて、不純物（硫化物）がダウンストリームの反応を阻害するのが大問題だったが、いまはよほど変なアガロースを使ってでもいないかぎりそんなことはないだろう。

(無題) 削除/引用 No.2078-10 - 2013/06/09 (日) 23:26:40 - ttt 下で指摘があったように、通常、コンピたんとセルさえ良い物があれば必要な数のコロニーを得るにはInsertもVectorもごく僅かな量しか必要ないので、私はElutionした後に濃度チェックとかはやったことがありません。 個人的な経験からは、ゲルからの抽出後のLigationに一番影響があるのは、UV照射の時間・残留アガロース・残留溶解バッファー・残留エタノールだと思っています。 参考までに、わたしのやり方を紹介すると、最近はエチブロの代替品で良い螢光試薬が出ていて、DNAの量さえ十分にあればUVを当てなくても見えますので、そういう時はUVは一切使いませんし、DNAが少なくて肉眼で見えない場合は、大体の位置にカミソリの刃を立てておいて、その後にUVを一瞬だけ当てて刃とフラグメントの位置関係を確認してから、UVを当てないでゲルを切り出したりしてます。 残留試薬を最小化するためには、プロトコールで遠心が十秒でも良いと書かれていても最低1分は遠心してます。カラムに残留する試薬が排出されるのには時間がかかりますから。それで最後に3分以上遠心して、乾燥したころを見計らってElution bufferをプロトコールにある最低量加えて溶出してます。

(無題) 削除/引用 No.2078-9 - 2013/06/09 (日) 20:23:03 - mon おそらく、ゲル溶解バッファの残存が原因だと思いますので、洗浄の回数を増やすと良いでしょう。 このようなトラブルがないGLサイエンス社製を愛用しています。

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