質問から、実際にどのような実験をしているか、分からない所があるので問題を絞りにくいです。
制限酵素で切って電気泳動を行っているのはインサート、ベクターの両方ですか？インサートだけですか？電気泳動が必要なほど、分けないといけない何かがあるのでしょうか？
目的物以外には小さい断片しか出ない場合は電気泳動を行わず同じキットでクリーンアップだけした方がDNAの収率は格段に上がります。
それぞれのサイズはどのぐらいでしょうか？
サイズが大きい場合には温めた溶出バッファーを使うことが推奨されていると思います。
制限酵素は一種類ですか、二種類ですか？
インサートをPCRで増やしているようですが、制限酵素で切れるのが数塩基しかない場合、切れたかどうかを調べる方法はないので、double digestionの場合に、実は片方が切れていなかったということもあります。
そもそもPCR産物だったら、まずクリーンアップしてから制限酵素処理して電気泳動してるのですか？分けたいものとの関連がありますが、PCRの副生成物を除きたいのであればまず電気泳動で分離してキットで精製してから制限酵素処理してクリーンアップ、の順番にすると、電気泳動に持って行けるサンプル量を増やしやすいと思います。
> ODのカーブが綺麗ではなく（OD280やOD260が低い）、収量も低すぎてうまくいきません。
ということですが、濃度の計算値はいくらですか？OD260がある程度以下であればナノドロップではカーブは線ががたがたします。単に装置の精度の問題です。カーブが綺麗ではない、というのは具体的に線ががたがた以外の意味でないとしたらそれは濃度が低いという事です。濃度が低ければ計算値と実際の濃度がかなり違うことも良くあります。
ですので、皆さんが濃度を電気泳動で確認してください、と説明されている訳です。
心配されているように電気泳動後のキット精製の収率が悪いだけでしたらそこまでのサンプル量を増やすのが確実性が高いと思います。現状では、どれぐらいの量を電気泳動で流して精製後のDNA量から収率はどれぐらいなのでしょうか？ |
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