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(無題) 削除/引用 No.4288-13 - 2015/07/22 (水) 17:40:15 - AP グルコースは終濃度0.1%程度でいいと思います。10-20%程度でストック溶液を作っておいて、培地に対して1/100-200体積加えるというので使い勝手がいい。 塗布でもいいでしょう。表面で濃度が高くなりますが、ボトムアガーの体積をベースに考えていいと思います。

(無題) 削除/引用 No.4288-12 - 2015/07/22 (水) 17:30:52 - たていす ＞ポジコンではコロニーは生えてきますし、 このポジコンとは、なんのことやら？ 使っているDNA ligaseに問題の無いことが判定できるようなコントロールなのかな？それともコンピがOKであることだけのコントロールなのか？ まずは、Ligaseが怪しんじゃないかなと思いますが、それなら、ligaseを買い直せば良いだけで問題はないことになります。 ＞上記の制限酵素 というのは、EcoRI/SalIということですか、上記などと言わないで明示すべきです。 EcoRI/SalIは、pGEM T-easyの切り出し用の制限酵素として付いていると思うのだけれど、あなたの書きようだと、 ＞制限酵素サイトつき(EcoR I,Sal I)の目的遺伝子をpGEM T-easyベクターにクローニング ということなので、PCRのプライマー部分にEcoRI/SalIを付けているように読める。 そうでないと良いのですが、ここが問題ではないかと思います。２つの制限酵素で切断したつもりが、インサートの両端は、同じ制限酵素で切れている可能性を少し疑います。 pGEMでクローンしたDNAをEcoだけやSalだけで切断してみると、1.4kbpがでなければ、別の理由なのでしょうね。 ＞制限酵素のエンドヌクレアーゼが影響し、、、、 ハマっている感じはよく伝わります。でも、そんなことは気にしないほうが良いだろうなと思います。

(無題) 削除/引用 No.4288-11 - 2015/07/22 (水) 17:29:52 - ぺーぺー そのポジコン、空ベクターに出現したコロニーは５、６個とかではなく、１００個か１０００個とかかは知りませんがキットの記述なりコンピテントセルの効率なりと整合性が取れる数あった訳ですね。 ちなみに、コンピテントセルの効率はどのくらいですか？

(無題) 削除/引用 No.4288-10 - 2015/07/22 (水) 17:24:13 - tora 培地にグルコースを添加する場合ですが、寒天培地表面にグルコースを塗布することは可能ですか。 可能であれば、塗布するグルコースの濃度について教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.4288-9 - 2015/07/22 (水) 17:19:03 - tora ぺーぺーさん ポジコン、空ベクターについてはそのとおりです。 ゲル抽出はキットを用いて行っています。キットを使うと制限酵素が除去されるということでしょうか？ APさん アドバイスありがとうございます。現在保有しているコンピテントセルがDH5αと BL21しかないので、培地にグルコースを加える方法を試してみようと思います。 培養温度条件についても検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.4288-8 - 2015/07/22 (水) 17:17:20 - AP 37℃ではなく室温や18℃で培養すると生えてくるというケースもあります。 おそらくこれも産物の毒性が原因で、低温だと発現量か速度が抑えられるため。 あとは、いつも言うけど、切り出しの時のUV被爆によるDNAのダメージでプラスミドが複製不能になっているケース。

(無題) 削除/引用 No.4288-7 - 2015/07/22 (水) 17:10:24 - AP >私は制限酵素のエンドヌクレアーゼが影響し、突出末端の削り込みが起こっているのではと考え まずないな。 発現ベクターをいじるときは、誘導をかけていないときにleakyな発現をどれだけゼロにするかが大事。そこが甘いと、産物によっては大腸菌が死んだり増殖が悪くなったりして形質転換体が取れないか、とれても増やせないことがある。 なので、DH5alphaはやめたほうがいいかもしれない。pGEX自体にLacI^qが乗っていてLacプロモーターからの発現をリプレスするようにはなっているが、宿主自体に強いLacI^q活性のある、XL1-BlueとかJM109を使ってみたら。それと、培地にグルコースを加えるのも別経路でLacプロモーターをリプレスするので、効果があるかも。

(無題) 削除/引用 No.4288-6 - 2015/07/22 (水) 17:09:48 - ぺーぺー ＞インサート、ベクターともに上記の制限酵素で37℃、1時間反応させ、電気泳動しバンドを回収しています。この際、制限酵素の不活化処理は行っておりません。 バンドの回収はゲル抽出を行っている訳ですね。キット（シリカカラム）で精製しているのであれば制限酵素の不活化云々は関係ないと思いますが…… ＞なにか原因を思いつく方は些細なことでもかまいませんので教えてください。 現在、私は制限酵素のエンドヌクレアーゼが影響し、突出末端の削り込みが起こっているのではと考え、制限酵素処理時間を検討して行っている最中です。 色々な意味で的外れだと思います。 とりあえず、ポジコン＝リガーセに添付してあるポジコン（セルフライゲーション等でライゲーション反応が上手くいっている確認）、空ベクター＝消化していないベクター用プラスミドという理解で正しいですか？

(無題) 削除/引用 No.4288-5 - 2015/07/22 (水) 17:07:19 - tora APさん ご指南ありがとうございます。 今後はそうしていきます。

(無題) 削除/引用 No.4288-4 - 2015/07/22 (水) 17:01:30 - AP お礼はともかく、ディスカッションの総括、成否の報告、解決につながったポイントなどをフィードバックするのは、こういうところでは常識というかmustのエチケットだわな。 >比較的気軽に相談でき、活発な議論がされているこちらを利用させていただいております 「利用する」という認識、根性がイカンわ。無料相談室じゃないんだから。 話題を提供する、意見や情報をのべるというかたちでディスカッションの場に「参加する」のだ。

(無題) 削除/引用 No.4288-3 - 2015/07/22 (水) 16:48:08 - tora すみません。現在切羽詰まっており、確かにアドバイスいただいた皆さまにはお礼を申し上げていませんでした。非礼についてはお詫びします。 しかし、ラボ内で検討をしていないわけではなく、なるべく多くの方に意見を頂きたいと思い、比較的気軽に相談でき、活発な議論がされているこちらを利用させていただいております。 今後はアドバイスしてくださった皆様を無視することがないよう気をつけます。 今一度知恵をお貸しいただけるとありがたいです。

(無題) 削除/引用 No.4288-2 - 2015/07/22 (水) 16:37:06 - aaa この方、質問を繰り返すだけで返答してくれた人たちは無視してますよね。 それより、この手の質問をラボ内で聞いて解決せず匿名のネットに頼ることに、この方の将来に不安を感じます。

ライゲーションが上手くいかない 削除/引用 No.4288-1 - 2015/07/22 (水) 16:09:20 - tora いつもお世話になっています。 今回はライゲーションが上手くいかない理由について皆様の知恵をお貸しいただきたいです。長文になりますがよろしくお願いします。 今、タンパク発現を目的として遺伝子のクローニングを行っています。 現在、制限酵素サイトつき(EcoR I,Sal I)の目的遺伝子をpGEM T-easyベクターにクローニングするところまでは完了しました。 次にそのプラスミドから制限酵素を用いて目的遺伝子を切り出し、発現ベクターであるpGEX-6P-1に挿入し、DH5αに形質転換しようとしているのですが、全くコロニーが生えてきません。ポジコンではコロニーは生えてきますし、未切断pGEX-6P-1の空ベクターを形質転換したものでもコロニーは生えてきます。 インサートサイズは約1400bpで、ベクターサイズは約5000bpです。 インサート、ベクターともに上記の制限酵素で37℃、1時間反応させ、電気泳動しバンドを回収しています。この際、制限酵素の不活化処理は行っておりません。 回収したバンドの濃度は問題なく（それぞれ50ng/µl以上）、TE bufferに溶解してあります。 回収したサンプルに、takara T4 DNA Ligaseを用いて、ライゲーションを行っています。ライゲーション反応は16℃、4時間、o/nと4℃、o/nで行い、 ベクター：インサートは1:1、1:3、1:5、1:8で行いましたが、どれもコロニーは生えてきませんでした。 ポジコンや空ベクターでコロニーが形成されているので、DH5αの形質転換能に問題はないと考えており、ライゲーションが上手くいっていないのが原因と考えております。 なにか原因を思いつく方は些細なことでもかまいませんので教えてください。 現在、私は制限酵素のエンドヌクレアーゼが影響し、突出末端の削り込みが起こっているのではと考え、制限酵素処理時間を検討して行っている最中です。

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