Bio Technical フォーラム

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No.4843-5 - 2016/02/14 (日) 16:49:28 - み
上手くいってなくて、しかも自身で解決できないのに頭でっかちなことをいうあたり、、、。
まあそれはさておき。
１マイクロリットルなど少量の添加が上手くできていないかも。
毛細管現象で逆流してチップから吐き出せていないのかな。
初心者には良くあること。
あなたが混ぜたものをホットスタートなしでかけるとか色々バリエーションを用意すれば解決する話じゃないですか。

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No.4843-4 - 2016/02/14 (日) 15:59:43 - PCR指導者
おお様からお知恵をお借りいただけるとは大変嬉しくおもいます。ありがとうございます。

Taqはhomemadeのものでラボテクの方が精製、調整、管理されてるものです（当方アメリカ在住です）。

とするとホットスタートが大事なのかもしれませんね。まったくmake senseではありませんが。。24歳にして本当に頭の良い子なのでその子の主張を尊敬してしまうんです。理由はよくわからないんだけど、こうやるとうまくいくようなんだ、というのが情けないというか科学的でないというか、、、

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No.4843-3 - 2016/02/14 (日) 15:45:35 - おお
When you have two choices--one is working and the other is not working, which one would you chose?

タックは種類によるかもしれませんが、室温で混ぜてもそんな影響がないかなと思います。ホットスタート（氷上からいきなりブロックにおくなど）は物によってはそれでないとうまくかからないものもたまにあります。

doesn't make sense

Ok, what do you think is the problem. If you do not have any other idea, shouldn't you try my protocol first?

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No.4843-2 - 2016/02/14 (日) 15:40:55 - PCR指導者
原則ではなく、経験則なのだ、ということをお伝えしたらいいのでしょうか？

PCRの指導法について 削除/引用
No.4843-1 - 2016/02/14 (日) 15:16:21 - PCR指導者
PCRの指導法についてお知恵をお貸しください。

今学部上がりの中国のPhD学生にPCRをやってもらっています。
私はこれまでに目的の遺伝子を特定のプライマーできちんと増幅できているのですが、彼女がやるとどうにも PCRがかかりません。

ゲノムのサンプルまで全く同じなのですが、どうしてこういうことが起こるのでしょうか？

私は氷上で、 PCRチューブに水、buffer、dNTP、Primerを入れ、ボルテックスしたのち、Taq polymeraseを加え、穏やかにpipatingしています。その後、ゲノムおよびネガコンの水を1 ul入れた新しいPCRチューブを氷上に置き、先ほどのmaster mixを24 ulずつ入れ、それをあらかじめ95℃になっているサーマルサイクラーに氷上から一気に置いてから PCR反応させています。

その子はどのような順序でmaster mixを作っているかわかりませんが、すべての操作は室温で行ってるみたいです。またサーマルサイクラーもおそらく室温の時にサンプルを置いていて、そのままstartボタンを押してPCRをスタートしてるようです。

彼女はshould be no problemというのが口癖なのかと思うほど、きちんと頭で考えていて、いい加減（私からみたら）でも問題ないだろうというのがあるのだと思います。

彼女がPCRがかからない原因はわかりませんが、氷上で PCRの反応液は作りなよー、とか私が好む95℃になってることを確認してからPCRサンプルを置きなさい、なんて言うと、そんなのはdoesn't make senseだよ、と言われてしまいました。

Taqはhot start用ではないので、きちんと氷上でmaster mixを作るべきだとは思うのですが、それ以外ではうん、確かに私自身それほど強く強制して何かが改善されるかどうか曖昧ではある、と思って躊躇っています。因みに私の PCRプロトコルでは100%シングルバンドが綺麗にでますが、彼女がやると全く出ません。
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