おお様、有難うございます。
実は一昨日、タンパク質をBL 21に発現し、可溶画分にきたと書きましたが、私の誤りでした。一昨日行ったのは大腸菌のペレットに1x SDS Laemuli sample bufferを加え煮沸処理したものでした。これを可溶画分と理解していました。ですが、実際には可溶画分も不溶性画分も一緒に抽出されてしまっていますよね。
そこできちんと可溶画分を抽出するため、論文に倣い、 mini culture 1 mlから得られた大腸菌ペレットを0.1 mg/mlのポリミキシン in PBS (総量500 ul)で4℃、一晩ローテーションしてみました。その後、10,000g, 5 minで遠心し、上清とpelletを得ました。pelletには1 x SDS sample bufferを加え、sonication後、boilしてサンプル調整しました。上清の方には6x sample bufferを加え、boilしました。結果、目的のタンパク質はpelletの方にしか現れず、当初、不溶画分に行ってしまったと思いましたが、そもそも上清の方にはCBBで染まるbandが一切なく、そもそもポリミキシンで細胞から可溶性タンパク質が抽出されているか懐疑的でした。
そこで、今朝は大腸菌pelletを1% Triton X-100を加えたPBSもしくは、ただのPBS 500 ulに大腸菌ペレットを懸濁し、1 minのsonicationを行いました。その後、10,000g, 5 minで遠心し、上清を可溶性画分とし、一方、pelletを不溶性画分と定義しました。
驚いたことにこの不溶性画分のpelletに1 x sample bufferを加えると、非常に硬く、pipetingではきちんと均一な溶液になりませんでした。これが封入体と呼ばれるものなのでしょうか？
結局、sonicationを1 min行い、ボイルすることで均一な溶液になりました。
今後調製したサンプルでSDS-PAGEを行い、CBB染色する予定でいます。
もし硬いpelletが封入体だったとすれば、1x SDS sample bufferではなく、8 M グアニジンや4 M尿素を使うのが常法だったでしょうか？
また、GST融合タンパク質として目的タンパク質を発現させる目的として、可溶性を高め封入体に取り込まれないようにするため、とありますが、そうはいってもGST融合タンパク質でも封入体に入ってしまうことは珍しくないのでしょうか？
非常に稚拙な質問を重ねてしまい、恐縮していますが、お手隙の際にご教示いただけますと幸いです。 |
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