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(無題) 削除/引用 No.5973-11 - 2017/05/19 (金) 08:46:14 - TS いろいろ参考になるご意見出ていると思います。 私の部分だけにレスします。 セレクションだけだと、shRNAカセットが入ってない細胞も残っています。 その程度は細胞によりますが。 そうすると徐々にポピュレーションが変わってくると思います。 もし増殖に影響が出るような遺伝子をターゲットにしてる場合は、 ひどく顕著に出ると思います。 実験の目的に応じてとは思いますが、クローニングするのが一般的と思います。

(無題) 削除/引用 No.5973-10 - 2017/05/19 (金) 08:08:34 - おお shRNAをTetなどで誘導できる系にすると、shRNAの影響によるパッセージ間の変化を防げるかもしれません。実際のそういう系は試そうとしたことがありませんので具体的にどういうのが良くてとか悪くてとかいうのはいえませんけど。

追記 削除/引用 No.5973-9 - 2017/05/19 (金) 02:15:58 - 駆け出し大学院生 プロモーターはU6です。

有難う御座います。 削除/引用 No.5973-8 - 2017/05/19 (金) 02:13:08 - 駆け出し大学院生 色々な可能性が考えられるのですね。。。 ＞TS 導入後、セレクションは行っていますが、クローニングはしていません。クローニングはした方が良いのでしょうか。。。 がん細胞を使用しております。 導入はLentivirusを用いております。セレクションはpuromycinです。 細胞表面マーカー（細胞接着因子）をknockdownさせています。 knockdownはFACSで確認して、発現が弱いものだけsortingして、その細胞を使ってinvasion assayを行ってmockと浸潤能の比較をしたりしております。 ＞おお shRNAの効果が弱いものが、ドミナントになる。。。その可能性は考えられます。その場合は、なるべく継代をせずにassayをするしかないでしょうか。 shRNAの効果も、当然ながら細胞によってヘテロなんですね。。。 このような場合、長期的に発現を落としたい場合は、CRISPR/Cas9などでKnockoutの方がいいでしょうか？？（動物実験などに使う場合） ＞mom silencing、、、とは何でしょうか？？申し訳ありません。無知なもので。。。

(無題) 削除/引用 No.5973-7 - 2017/05/18 (木) 17:42:07 - おお フィードバックがかかってその蛋白の安定性が変わるっているシナリオもあるかもしれませんねぇ。

(無題) 削除/引用 No.5973-6 - 2017/05/18 (木) 15:02:05 - おお >そんな中で比較的shRNAの効果が徐々にドミナントになって来る場合もあるかもしれません。 訂正 そんな中で比較的shRNAの効果が弱い細胞が徐々にドミナントになって来る場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5973-5 - 2017/05/18 (木) 14:38:50 - mon おおさんも述べていますが、がん細胞だとゲノムの不安定がありますので、shRNA発現ユニットがdeletionしたクローンが増えてくることも考えられますね（特にshRNAが増殖にnegativeに働く場合）。

(無題) 削除/引用 No.5973-4 - 2017/05/18 (木) 14:18:15 - おお 必ずしも徐々に落ちるわけではないと思いますが（安定導入であるという前提で話してますけど）。 可能性としてはいろいろ論じることができると思います。 安定導入でもタンパク質の発現などでも、だんだん弱くなることがよくあります。これはベクターのプロモーターが徐々に不活性化されるためで、強いプロモーターでよく起こりがちです。 また細胞は正常細胞でないかぎり、ヘテロな集団でできていますし、シングルのクローンをとっても色々バリエーションをもってヘテロになっていきます。そんな中で比較的shRNAの効果が徐々にドミナントになって来る場合もあるかもしれません。 またshRNAのターゲットの部分がコーディングリージョンでないなら選択的スプライシングで制御されないmRNAがフィードバックなどでドミナントになる可能性もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.5973-3 - 2017/05/18 (木) 13:05:08 - TS 導入後、セレクション、クローニングして安定的に発現させたんですか？

(無題) 削除/引用 No.5973-2 - 2017/05/18 (木) 12:32:10 - mon shRNA発現ユニットのsilencingが生じているのでは？？ CRISPR/Cas9を用いたknockoutは、ゲノムDNAを改変（deletion等）するので、効果は永続的です。

shRNAの持続性について 削除/引用 No.5973-1 - 2017/05/17 (水) 20:48:56 - 駆け出し大学院生 一般にsiRNAは一過性のknockdown、shRNAは持続的なknockdownということが教科書的には書かれています。 しかし実際にはラボの人に聞くと、shRNAをvectorによって導入後、knockdownの効果が最初と、ある程度継代して時間が経ってからでは、徐々に落ちてきてしまうと聞きました。 実際に、そのような事例を経験したのですが、（導入後、10〜15継代程で）これはどのような理由からなんでしょうか？？ shRNAは持続的なknockdownが期待できるのでは無いのでしょうか？ 又CRISPR/Cas9を用いたknockoutでは、このようなことは起きないのでしょうか？？教示頂ければ幸いです。。。

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