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(無題) 削除/引用 No.6702-4 - 2018/02/19 (月) 07:23:00 - question 申し訳ないが、何が問題なのかがイマイチわからないです。もちろん、必要（と思われる）情報をキッチリ載せようと頑張られたのはわかるのですが…。 1)　前任者が残したRNA、ｃDNAを使ってもなんとうまくいかないのです。 前任者の残したRNA、cDNAを使って、前任者がやったのと同じ方法でqPCRをかけても上手くいかないということでしょうか？どこまでが質問者様がやったことで、どこまでが前任者までの仕事なのか、もうすこし噛み砕いて書いて欲しいです。（それと、そもそもその前任者の仕事は信頼できる結果なのでしょうか？） 2）いきなりGAPDHでダイマーができ、そこからGAPDH他様々なプライマー（例えば論文に非常によく使われている配列から自分のデザインのものまで）を相当数試しましたが、PCR効率がほとんど常に80％を切ることが分かりました。 プライマーダイマーが出来ることと、効率が100%前後にならないことは別事項として捉えた方が良いと思います。どんなプライマーでもダイマーが出来るということなのですか？どんなプライマーセットでも（発現が多そうなものでも、少なそうなものでも）効率が80％前後になるということなのですか？

(無題) 削除/引用 No.6702-3 - 2018/02/19 (月) 05:46:53 - 煎餅 大事な情報を忘れていました。 Genomic DNAのコンタミは、計算上62.5pg相当のRNAのNon-RT コントロールを用いてｑPCRで30ー35サイクル程度に増えるはコンタミがありました。DNaseトリートメントは前任者は施行しておらず、私も実施しましたが、それによって効率を十分に改善することはできませんでした。 Non template controlは増幅はありません。 10ulのｑPCRの系の時にはｃDNAは2ul入れることにしています。 分かりにくい点も多いかと思いますが、どうぞよろしくお願いいたします。

ｑPCR実験：PCR効率が改善しない 削除/引用 No.6702-1 - 2018/02/19 (月) 05:20:07 - 煎餅 表題の件で長い間大変困っておりますので、ご助言頂けませんでしょうか。 新しく海外の施設に移り、ｑPCRを行っています。目的は前任者が行ったRNAseqの結果のvalidationです。前施設での仕事でSYBRGreenを使ってｑPCRを特に問題なく行っていたため、簡単にできるであろうと当初は思っていました。 まず、私の前任者が、ｃKO　Mouse大脳皮質からTdtomato発現細胞をFACSソーティングにて採取、Trizol-LSをベースに更に手を加えた方法でRNAの抽出を行い、微量のRNAよりシークエンスを行っていました。バイオインフォマティクスの共同研究者もおり、シークエンスは既に完了し、ワークしているようです。前任者は一部RNAよりｃDNAを作製し、Taqmanプローブでいくつかの遺伝子に対して数回ｑPCRを行っておりました。少なくとも5段階の希釈系列（2分の１希釈）はうまくできておりました。 前任者が既に残してくれた、ソーティング後に採取したRNAサンプルがそれなりのサンプル数で残っており、私もそれを使いたいので、まずはWTのマウス大脳皮質より、同様の方法でRNAの採取、ｃDNA合成を行い、自分の良く知っているSYBR Greenのプローブいくつかでまずは開始しました。マスターミックスはInvitrogenの Power SYBR Greenで、これは以前使っていたものと同じです。しかし、いきなりGAPDHでダイマーができ、そこからGAPDH他様々なプライマー（例えば論文に非常によく使われている配列から自分のデザインのものまで）を相当数試しましたが、PCR効率がほとんど常に80％を切ることが分かりました。 その後自分の問題点を洗い出すためにずいぶん試しましたが、最終的に前任者が使ってワークしたGAPDHその他Taqman　プローブを使ってもなお、自分のTrizol の標準的な方法で作ったRNA（私のRINは８程度、ODは260／280、260/230はともに2.0-2.2くらいです）のみならず、前任者が残したRNA（ODは260／280が2前後、260/230は1.3-1.7という値なのですが・・・）、ｃDNAを使ってもなんとうまくいかないのです。ｃDNAはSuper　Script�Uにランダムヘキサマーを用いています。私の希釈方法は以前は1／10の5点希釈でしたが、今回は発現量が低いものもあるため、1／4の5点希釈にしています。 前任者の時と変えたものはチップをフィルター付きのものに、水をDEPCトリートメントのものからDEPCなしのRNase/DNase-freeのものに変えたくらいです。私のテクニックの問題かと思い、DNAを扱うコアの方に一度実演して頂きましたが、それも効率は80％程度でした。ｑPCRの機械は96well と384wellの両方試しましたがどちらもダメでした。 トリプリケイトは大体問題がなく、一致していることがほとんどです。増幅曲線の幅が不均一で、最初の希釈だけ間隔が伸びていることが多いのですが、低濃度で伸びることもあります。希釈はずいぶん注意して実験ごとに作っているのですが、・・・・ いったい何をどうすればよいのか全く分からなくなりました。どうぞ何か思われることがありましたら、アドバイス頂けませんでしょうか？よろしくお願いいたします！

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