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(無題) 削除/引用 No.311-23 - 2009/04/16 (木) 21:14:33 - poor研究者 Immobilon は使っているのですが、安いのですが、どうも substrate が切れるのが早い気が・・・。 PS3 は買えないのですか。残念ですね。 抗体の使いまわしも重要ですよね。 ＩＰで多量の抗体を使うので、ＩＰに使った抗体が使いまわせたらいいのですが・・・。 6 well plate の１ウエルの COS7 に強制発現したものを IP するのに、0.5μg の抗体を使っているのですが、条件検討して減らしてみようと思ってます。 preabsorption に 15μl bed vol. の sepharose、IP 用に 5μl bed vol. の sepharose を使っているのですが、こちらももう少し減らせるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.311-22 - 2009/04/16 (木) 10:58:59 - まうす ルミノールナトリウム塩ＨＧ〔Luminol Sodium Salt HG: 和光〕を使用すれば、ただのluminolを使うよりは感度が高くなります。ECL plusと比較したことはありません。 興味があったので、ちょっと調べてみた所、ルミノールの数百倍！と宣伝している化学発光基質　L-012　（Wako)を見つけました。原理的にはHRPでの検出に使えるのではないかと思いますが、皆さんのご意見は如何でしょうか？ これらは、luminolと比較してかなり高価です。感度を求める場合はやはり価格との兼ね合いになるのではないでしょうか？ 私は、感度が必要ない場合は自作で、感度を求める場合は、MilliporeのImmobilon Western HRP Substrateを使用しています。ECL plusと比較しても遜色ないです。この試薬はスプレータイプがあり、私は使ったことはないのですが、使用量を減らせそうな印象を持っています。 http://www.millipore.com/immunodetection/id3/westernblotreagents 抗体をケチることもが目的のようですが、一次抗体の使い回しはやられていますか？大体３−４回程度は使い回せると思います。シグナルが落ちてきたら、もう一度ブロットをやり直せば良いだけですし、かなり節約になりますよ。

(無題) 削除/引用 No.311-21 - 2009/04/16 (木) 08:15:16 - おお >[Re:20] poor研究者さんは書きました : > 自作で ECL+ 程度の感度が出ればと思うのですが、さすがに無理ですかね？ > 抗体をケチろうと、希釈倍率を ECL+ にあわせて薄めてきていたので・・・。 > http://ns.lumigen.com/documents/LumigenPS3.shtml ECL PLUSのルミノージェンはPS3というケミカルを用いています。 でむかしこのケミカルが他の会社(シグマとか)で単体で買えないか 探したのですが見つかりませんでした。ライセンス、特許などの 関係かもしれません。 ECLのシステムはまあたいていの場合十分ですが300pgが検出限界 とされていて、発色色素がでだせる100pgより悪いですし、ECL がでたころ発色色素もたいていECL並みにバンドだせるよと 自慢していた人もいました。 APを使うシステムは非常に優れていますので、そちらに移行した方も いるのかなあという気がしますがこの辺はどうなんでしょうね。 APだと多分自作でケミルミ用試薬がつくると思いますが。 コスト面で計算したことはないです、、、、

(無題) 削除/引用 No.311-20 - 2009/04/16 (木) 06:38:08 - poor研究者 自作で ECL+ 程度の感度が出ればと思うのですが、さすがに無理ですかね？ 抗体をケチろうと、希釈倍率を ECL+ にあわせて薄めてきていたので・・・。 ＞あべちゃんさん お返事ありがとうございました。 Pfu と DpnI だけで出来るんですね・・・。 恥ずかしながら、ニックは transform 時に大腸菌内で修復されることを（今日調べて）はじめて知りました。 ＞まうすさん 詳細なプロトコルをありがとうございました。 これでまた大分節約できそうです。 pCR-TOPO は効率は良いのですが、高かったので・・・。

DNAマーカー自作 削除/引用 No.311-19 - 2009/04/15 (水) 15:24:00 - まうす これは手持ちのベクターを適当に安い制限酵素で切断し、適当に混ぜるだけです。一種類の酵素による切断だけでは、マーカーとしては不十分ですので、2−３種類の酵素でそれぞれ切断したDNA断片を分量を調整して混ぜています。これで高分子量から低分子量まで大体網羅出来ています。

Tベクター自作 削除/引用 No.311-18 - 2009/04/15 (水) 15:09:54 - まうす Digest cloning vector with the enzyme that make blunt end Purify the digested vector Prepare following solution in PCR tube DNA solution10 micro L (1 micro g) 10x PCR Buffer10 micro L 10 mM dTTP20 micro L Taq polymerase1 micro L dH2O59 micro L Add one drop of mineral oil Incubate at 70 oC for 2 hr in Thermal cycler Add 100 micro L of Phenol (for DNA) Mix by vortex for 10 sec Centrifuge at 15000 rpm for 5 min Transfer sup into new tube Once more Add 50 micro L of CIA Mix by vortex for 10 sec Centrifuge at 15000 rpm for 5 min Transfer sup into new tube Add 1/10 vol (10 micro L) of 3 M sodium acetate (pH 5.0) Add 1 vol of isopropanol Mix by vortex Centrifuge at 15000 rpm for 10 min Rinse with 70 % EtOH Dry Add 10 micro L of TE to dissolve pellet Divide into 1~2 micro L of aliquot Store at –30 oC until use

ケミルミ自作とTベクター 削除/引用 No.311-17 - 2009/04/15 (水) 15:06:34 - まうす １、ケミルミ自作 参考文献 Yakunin AF and Hallenbeck PC. (1998) 'A luminol/iodophenol chemiluminescent detection system for western immunoblots'.  Analytical Biochemistry 258, 146-149.

(無題) 削除/引用 No.311-16 - 2009/04/15 (水) 01:07:51 - ami [MACSカラム使いまわし] 使用後すぐ洗わないときは冷蔵庫に→カラムの上部を70% EtOHで3回リンス→70% EtOHをプランジャー使って3回通す→乾燥機で乾燥→オートクレーブ(終了後はすぐ取り出す)→乾燥機で乾燥→また使える

(無題) 削除/引用 No.311-15 - 2009/04/14 (火) 21:22:21 - C 100円ショップを活用。容器とか、使えそうなもの結構ある。 ペーパータオルとか台所用品なども。 通販も結構いい。（ネットでさがすと理科実験機器など教育目的のもので、ガラス器具や消耗品などいろんなものが安く売ってます。） ゲルは一番小さいミニゲル使う。and SDS電気泳動はよくゲル濃度を考えて見たい部分が見えるようになったら下まで流さないで止める。and １次抗体の反応はもちろん袋でやる。小さいゲル、小さい膜、少量の抗体。という感じ。２次抗体は時間差で連続使用。ウェスタンとかはある程度サンプルまとまってから一度にやる。 ECLはもちろん自作。みんな馬鹿にしますが、感度は市販のものと同等と思います。それにバックは市販よりも低くてきれいです。もう長いこと買ってません。 大型機器は借りる。 培養細胞は小さいシャーレ使う。単なる継代培養なら十分。

(無題) 削除/引用 No.311-14 - 2009/04/14 (火) 20:39:48 - あべちゃん >[Re:13] poor研究者さんは書きました : > 無駄なことといえば、mutagenesis に QuickChange を使っていたことでしょうか？ > 20μl の系にスケールダウンしても、１反応＝2000円超であることを最近知りました。 > みなさんはどうされているのでしょうか？ high fidelityのDNAポリメラーゼと制限酵素Dpn1を購入する。

(無題) 削除/引用 No.311-13 - 2009/04/14 (火) 20:08:24 - poor研究者 無駄なことといえば、mutagenesis に QuickChange を使っていたことでしょうか？ 20μl の系にスケールダウンしても、１反応＝2000円超であることを最近知りました。 みなさんはどうされているのでしょうか？ ＞通りすがりさん ありがとうございました！ そのようなサイトがあったのですね。 大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.311-12 - 2009/04/14 (火) 09:52:40 - ＊ 器具の洗浄で節約術ありますか？ 当部屋は、無限希釈と称し、バケツに器具を入れて水道水を上から入れ続ける事丸一日。 これって、無駄ですよね〜？ 逆に、無駄だと思う事は無いですか？ 滅菌が必要ない、ティップやエッペンチューブなどもまとめて意味も無くしているとか？ ありませんか？

(無題) 削除/引用 No.311-11 - 2009/04/14 (火) 09:23:35 - あべちゃん >[Re:8] poor研究者さんは書きました : > みなさん、様々な節約法をありがとうございました。 > 3.5 or 6cm plate に大腸菌をまく、細胞培養のディッシュの再利用、トランスフェクションにPEI　は大変参考になりました！ > COS7 での co-IP はルーチンなので、PEI 法は何とかものにしたいと思います。 僕もこのフォーラム内で、atsさんが教えて下さったPEI法を利用させてもらっています。 ルーチンでトランスフェクションしなくてはならず、とても助かってます。 この掲示板の履歴を探せば方法が書いてあります。 僕が改めて投稿するのも良いですが、ちょっと気が引けるので。

(無題) 削除/引用 No.311-10 - 2009/04/14 (火) 00:43:08 - ううう 皆さんご存知の悪名高いサイトのスレですがここで幾つか使える節約術が 拾えます。既に上がっている節約術もかかれてますし、信用できない 情報もあるかもしれませんが。 http://science6.2ch.net/test/read.cgi/life/1029764447/

(無題) 削除/引用 No.311-9 - 2009/04/13 (月) 23:55:19 - 通りすがり マーカーは探せば色々ありますよ。 pUC19/MspIとかが販売もされていて有名ですかね。 カタログとか、 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100003633 こんなんを参考に好きな(持っている)DNAを好きな(安い)酵素で切ればいいです。 良く使われるλ/HindIIIも、λDNAを買って適当な酵素で切れば、いろんなサイズが作れます。 TベクターはTを後で付けたり、専用のベクターを設計して、制限酵素で切って調整したり。 後者は論文になってて、過去のフォーラムでも出ていると思います。 他の方のように、洗って再利用したり、ディスポ製品をガラス製+洗浄+乾熱にしたり、キットなどを極力使わないようにすればかなり浮くと思います。 プリンターインクは詰め替え。 TAEは薄めて使う。 アガロースの切り出しは、キットを使わない。 滅菌テープは1,2cmで、後は安いマスキングテープなどを使う。(一巻きで一年くらい持つｗ） PCのソフト類は極力フリーソフトを使う。

(無題) 削除/引用 No.311-8 - 2009/04/13 (月) 20:37:12 - poor研究者 みなさん、様々な節約法をありがとうございました。 3.5 or 6cm plate に大腸菌をまく、細胞培養のディッシュの再利用、トランスフェクションにPEI　は大変参考になりました！ COS7 での co-IP はルーチンなので、PEI 法は何とかものにしたいと思います。 ＞まうすさん ウエスタンのケミルミの自作、TAクローニングのTベクターの自作　は具体的にどのように行うのでしょうか？ 後、マーカー作成用のプラスミドと酵素の組み合わせは、オススメのものはございますでしょうか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.311-7 - 2009/04/13 (月) 18:03:06 - ~ 今のラボでは時間優先なので、ほとんど節約していません。 昔いたラボでは、 15mL、50mLチューブ、6cm、10cm細胞培養用ディッシュは洗って再利用。 細胞培養用ピペットはガラスを使い、洗浄→乾熱滅菌で再利用。 大腸菌のコンピはケミカル、エレクトロ両方とも自作。 エレクロトコンピ用のキュベットは洗って再利用。 プラスミド調整は基本的にはアルカリSDS、トランスフェクション用はPEG沈で精製。 カラムを使ったら、インサートチェック用などに使いまわす。 トランスフェクションはリン酸カルシウム法。 確認用のDNA電気泳動では、TAEは泳動槽に入れて使いまわす。減ったらイオン交換水で希釈。 後染め用のエチブロも共通で入れっぱなし。 学生さんのピペットマンは、2~3人に1~2セット。 有償で引き取ってもらう廃液は、基本ドラフトで飛ばす。 手袋はサンプルを守る必要が無い場合はしない。

節約術 削除/引用 No.311-5 - 2009/04/13 (月) 15:53:56 - まうす rTaqは自作です。TG mouseのgenotypingに使用しています。 TG mouseの尻尾からのPCR用DNA抽出には、NaOH boiling法を用いて、時間とお金を節約しています。 細胞培養のディッシュの再利用　293やNIH3T3なら問題はないと思います。（自己責任で） ディッシュも、安い国産を使用しています。 培養に使うピペットは、ガラス製で、超音波洗浄して、乾熱滅菌して使い回しています。 培養で使用した15, 50cc tubeは洗浄後、オートクレーブして再度培養実験で使用しています。変形するまで使い回せます。 あべちゃんさんと同様に、トランスフェクションにPEIを用いています。 1ml 8万円がほとんどタダになります。 制限酵素のユニット数は、厳密に（DNAに対して2-3倍ユニット程度）。 10倍量入れる人がたまにいますが、必要ないと思います。 培養細胞へのトランスフェクション目的以外では、DNA精製用のカラムは使いません。 Mini-prepでの精製には、Boiling methodを用いています。チューブの節約になります。 Stable transfectantを作製する場合、pIRESpuro3, pIRESbleo3等のIRESベクターを使用して、クローニングの手間を省略します。培地と血清とディッシュの節約になります。 血清は、500mlの培地に直接加えるのではなく、50mlチューブに取り分けた血清からその都度必要な分を分注しています。血清を大事に使うようになります。 安いアガロースで切り出しを行っています。高い切り出し用のアガロースは必要ないです。 ウエスタンのメンブレンは、目的のバンドサイズの部分を切り出して、メンブレンサイズを小さくして、抗体溶液などをケチっています。 （はじめての抗体の場合にはこの限りではありません） ウエスタンのケミルミの自作。 合成オリゴの注文量が多い場合には、業者と交渉出来ます。 TAクローニングのTベクターの自作 DNAマーカーの自作　適当なベクターを制限酵素で切断して混ぜてマーカーとして使用しています。 DNA ligation kitは、極力最新の高効率のものを使用しています。 実験で使用するラテックス手袋の再利用　破れるまで。 （安い物はすぐ破れるので、そこそこ良い物を使っています） ラボのdata storageをLinuxで自作 NASとか買うと高いですから。 カラープリンターの使用制限

(無題) 削除/引用 No.311-4 - 2009/04/13 (月) 09:45:56 - あべちゃん 消耗品は、いくつかのメーカーの商品を複数の業者に見積もらせる。 血清で異様に安いフランスのメーカーがあったと思います。 トランスフェクション試薬は高価なので、リン酸カルシウムやPEIで代用する。

(無題) 削除/引用 No.311-3 - 2009/04/13 (月) 09:05:19 - おお あ、もう一つ。 癌細胞などでよく増える昔からある細胞で扱いが難しくないような 物に限って6ー7%にバイチの血清濃度をさげる。

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