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低温培養 削除/引用 No.385-41 - 2009/04/29 (水) 13:05:44 - ats 多少内容がずれますが、stbl3で最近経験したことをお話します。 lentivirusのベクターにGATEWAYシステム（組換え反応）で「とあるcDNA」を入れようとしましたが、deletionクローンのような変なものばかり取れました。 そこで解決策として、遺伝子導入後寒天培地での培養を20度で行うと、まともなクローンばかり取れました。plasmid調製用の大量培養も20度で行い、収量は少な目でしたが正常なplasmidがとれました。ちなみに、pENTRに入っている「とあるcDNA」plasmidは、37度培養でも正常です。 参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.385-40 - 2009/04/29 (水) 08:09:14 - おお >[Re:39] 苦労人さんは書きました : > >おおさん > > アドバイスありがとうございます。 > そういえば、泳動そうはあまり洗ってないです。 切出しをやるなら、ゲルをセットする前に水洗いで良いですから よく洗ってください。インサートの長さは一緒でも中身が違ったり とか変なことが起こると結局やりなおさなければ行けませんし。 複数のポイントミューテーションが入ったものを複数使っていれば 知らない間に入れ替わってたりしてたら目も充てられません。 > > いい忘れましたが、 > ベクターの大きさが6700くらいですが、大きなベクターを使っていて、 > コンピテントセルは普段はDH5aですが、今回はStbl3を使いました。 > そういうのも、関係してきますか？ 今回の場合はあまり関係ないかと、、、Stbl3の細い特性は すぐに思い出しませんが(インバーテッドなど繰り返し配列の リコンビネーションが起こりにくいようになっているのはしってますが)、 ま、関係ないとはいえ遺伝型からくる特性以外にも若干 クセみたいなのもあるようで、大腸菌を代えたらうまく行った という話はまあまああるようです。

(無題) 削除/引用 No.385-39 - 2009/04/29 (水) 06:25:46 - 苦労人 >おおさん アドバイスありがとうございます。 そういえば、泳動そうはあまり洗ってないです。 いい忘れましたが、 ベクターの大きさが6700くらいですが、大きなベクターを使っていて、 コンピテントセルは普段はDH5aですが、今回はStbl3を使いました。 そういうのも、関係してきますか？

(無題) 削除/引用 No.385-38 - 2009/04/28 (火) 21:57:50 - おお >[Re:37] 苦労人さんは書きました : > >おおさん > > ポジティブらしきクローンを一つ見つけましたが、ひとつだけだったので > 危なかったです。 ひとつですか、、、何かまずいところがあるような気がします。 ベクター側の問題では内容な気がしますのでインサート側の問題でしょうか。 > > ポジティブでないクローンの中に、制限酵素処理で空ベクターでもない変なパターンを示すものが > あるのですが、こういうのはどう解釈したらいいのでしょうか？ 例えば、制限酵素で切ったプラスミドは弱いですけどトランスフォーメーション 活性があります。そういう場合末端は大腸菌が適当につなげてしまった状態 になっていると思います。ですから、従来の制限酵素認識部位のないプラスミド が出来上がったりします。 あとは、電気えいどうそうなどからくるコンタミの可能性とか環境によっては あると思います。少なくとも十分に水洗いして、新しいえいどうバッファーで 流すようにしたほうがいいです。 DNAの除去をもっと確実にしたいなら塩酸で１度処理しておいた方がいいです。

(無題) 削除/引用 No.385-37 - 2009/04/28 (火) 04:45:56 - 苦労人 >おおさん ていねいなコメントありがとうございます。 ポジティブらしきクローンを一つ見つけましたが、ひとつだけだったので 危なかったです。 ポジティブでないクローンの中に、制限酵素処理で空ベクターでもない変なパターンを示すものが あるのですが、こういうのはどう解釈したらいいのでしょうか？ 精製度の問題なのか、切れのこりなのか、別の遺伝子がライゲーションされているのか、なんなんでしょう？

(無題) 削除/引用 No.385-36 - 2009/04/27 (月) 06:26:59 - おお >[Re:35] 苦労人さんは書きました : > > SmaIとBamHIでdouble-digestしたものをligationしたところ、100個程度のコロニーが生えていたのですが、これは普通なんですか？それとも制限酵素処理が完全なら、コロニーは0というのが理想なのでしょうか？ > > ちなみにinsertをligationしたものは、1000個以上コロニー生えてます。 100個程度ちょっと多いですけど悪くない数字と申し上げておきます。 ただこれは感覚的なものです。貴方のコンピテントの 質と使ったDNA量がまず分かりませんから、、、、 それとインサートのライゲーションで10倍以上なので インサートになるフラグメントの調製で問題がなければ 多分目的の物は取れていると思えます。 ご指摘の件は始める時のデザインで次第で結論が出たと思えます。 その100と言う数字をどう評価するか、つまり インサートなしのライゲーションで得られた数をどう評価するか と考えるならもうチョット工夫ができたのではと思えます。 片方の末端の切れ残りを気にするなら、それによるセルフライゲーション が気になるわけですよね。それであればライゲーションしていない コントロールを取れば良いと思いませんか? 私は余裕があればベクターだけインサートなしで、ライゲーション したものとしてないものを比べます。両者に殆どさがないか、 ライゲーションで10倍クラい多く出てくるならまずよしとしています。 さらにライゲーションした時のコロニー数を参考に、インサートなしライゲーション で10個以下のコロニーがでる量のベクターを使いインサートのライゲーション に使います(この時DNAは電気えいどうでエチブロで辛うじて検出できるくらい の量なので5-10ngでしょうか)。そうすると拾ったクローンがあたりの確率は可也高く4くらいクローンを拾えば少なくとも3こはあたりです(ただ難しいとかインサートの向きとか、いろいろな要素がありますのでいつも そうとは限らないですが)。 取れればよしのテクニカルな部分もあるのでどれだけ 厳密に進めるかはその人しだいだと思うのですが、 やった事のない、感覚のない実験系であればいろいろ コントロールやあり得ることを想定して系をくんで、 熟知するようにした方が、その後問題を解決しやすく なると思います。 またそうした熟考は実際のバブリッシュしようとする (あるいは特許など違う目的でも)実験をするとき 重要なので、ただかサブクローニングと思わずいい トレーニングだと思って取り組んでほしいと思います。 ただ、研究補助をされている方であれば、そこまでは 厳しくいいませんが、言いなりでやるよりは考えた 方がいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.385-35 - 2009/04/27 (月) 04:03:39 - 苦労人 みなさん、多くのコメントありがとうございます。 勉強になります。 >私は、こういうとき、EcoRVとBamHIでdouble-digestして、vectorだけでligation/transformします。 SmaIとBamHIでdouble-digestしたものをligationしたところ、100個程度のコロニーが生えていたのですが、これは普通なんですか？それとも制限酵素処理が完全なら、コロニーは0というのが理想なのでしょうか？ ちなみにinsertをligationしたものは、1000個以上コロニー生えてます。

(無題) 削除/引用 No.385-34 - 2009/04/26 (日) 16:04:43 - AP 少々話がわき道にそれますが、 微量の切れ残りのベクターが残っていてnon-recombinat colonyのバックグラウンドがあっても、易しいサブクローニングくらいならrecombinantが十分にたくさん生じるので問題になりません。しかし、目的のrecombinantができにくい難度の高いコンストラクションだと、せっせと拾ってもnon-recombinantばかりということになるので、切れ残りのベクターの排除は重要です。たとえば10^9 cfu/ug plasmidのコンピーテントセルを形質転換するとき、1 pgの切れ残りのプラスミドがあれば、それだけで10^3個はコロニーが出てきますから。こういうときは制限酵素消化したベクターもゲルから切り出して精製するに限ります。 なぜかというと、アルカリ法で精製されたcccプラスミドには多かれ少なかれ、不可逆的部分変性して、二重鎖のresgistrationがおかしくなっていて、どんなに丁寧に制限酵素処理しても切れないフラクションがあるからです（文献も出ているし、多くの実験書でも指摘されていると思いますが）。少量とって電気泳動してみて完全消化できているようでも、切り出しなどで大量にロードしたり、サザンなど高感度の検出をすると必ずといっていいほど、切れ残りが見えてきます（ほぼcccと一致する位置、厳密にはやや移動度が異なる）。実際上は、手技の不手際による切れ残りより、こちらの方が確率も影響も大きいと思います。特にアルカリ変性処理をあまり厳密にコントロールないで精製したhome-madeのベクターだと、切れ残りのフラクションがかなり多い場合があります。

(無題) 削除/引用 No.385-32 - 2009/04/26 (日) 12:15:49 - qq なるもどねぇ・・・ こんどやってみよ。

切れ残り 削除/引用 No.385-31 - 2009/04/25 (土) 22:07:18 - Tb 制限酵素での切れ残りは、再現性がある場合は、確かに２つの制限酵素サイトが近すぎるとか、バッファーがあわないとかが理由だとおもいますが、もう一つ手技的なことがあると思います。 それはチューブ壁とかにくっついて制限酵素で切れにくくなっているDNAがあるのではということです。単純にバッファーとか酵素の撹拌中にピンとDNAをチューブの液面より上にはねて乾いた状態のDNAができていたり、あるいは液中でもチューブ壁に吸着されたDNAは切れにくくなっているとか。私は切断インキュベーション中に一回は新しいチューブに移します。これにより、ちゃんと反応している液層の部分だけを取ってくるということです。入りにくいもの（長いもの、制限酵素サイト付きプライマーでPCRしたものを無理にダイレクトで切断したもの）を入れるときは、わずかなuncutが浮き出てきますので重要だと思っています。 また、入っていない、あるいは別のものが入っている、という時、シークエンスしてみると大腸菌のゲノム断片が入っていたりします。入りにくいものの時には、カットしたあとベクターをゲル精製するとこれらのへんな産物がなくなり、すきっとします。 もっとも、入りやすいもののはずなのに入らない、という時はたいていは自分の計算違いがもとですね。

(無題) 削除/引用 No.385-30 - 2009/04/25 (土) 20:46:51 - おお >[Re:23] new power generationさんは書きました : > 誰もコロニーPCRを勧めないのはなぜでしょうか。。。 > > 個人的には８個つついて当たりが無いことはよくあるので不思議には思わないですが。 私はそんなことはほとんど無いです。うまくすべてのステップやコンピテントの質を確実にしておけばまず80%悪くても50%の割合で取れます。 コロニーPCRを否定しませんが、あまり生産的ではないともおもえます。インサート3kb以上なのでプライマーを注文しないといけないかもしれませんね。 コロニーPCRも過去ログでかなり議論されています(ひとつ前か2つ前のフォーラムで)。一度参照してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.385-29 - 2009/04/25 (土) 05:10:04 - おお >[Re:28] 苦労人さんは書きました : > >私は、こういうとき、EcoRVとBamHIでdouble-digestして、vectorだけでligation/transformします。 > コロニーが出るようだと、どちらか一方が切れていないので、切れにくい方で最初に切断して、ゲル抽出して、次の切断をかけてゲル切りだしします。そうすると、切断の難しい方が100%切断できています。 > > いい方法だと思います。 > もう少し簡単に少量のベクターをEcoRVとBamHIでsingle cutして、 > 泳動してキレのこりがあるか確認というのはだめでしょうか？ 切れ残りが1%あるとして、検出できるかどうか コロニーがどれだけはえるかというのを考えるといいとおもいます。 そうかんがえるとステップワイズでやるのがあるいみ理想的とおもえます。 私はどちらかの酵素で切れていないかもと思える時はCIAPなどフォスファターゼ処理をすることもあります。 もしEcoRV BamHIのあいだにインサートをいれたプラスミドをお持ちでしたら そこからEcoRV BamHIの末端を持つベクターを得ると、電気えいどうで 切れ残りのないフラグメントを認識しやすいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.385-28 - 2009/04/24 (金) 23:41:11 - 苦労人 >私は、こういうとき、EcoRVとBamHIでdouble-digestして、vectorだけでligation/transformします。 コロニーが出るようだと、どちらか一方が切れていないので、切れにくい方で最初に切断して、ゲル抽出して、次の切断をかけてゲル切りだしします。そうすると、切断の難しい方が100%切断できています。 いい方法だと思います。 もう少し簡単に少量のベクターをEcoRVとBamHIでsingle cutして、 泳動してキレのこりがあるか確認というのはだめでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.385-27 - 2009/04/24 (金) 23:38:40 - 苦労人 >コロニーが出るようだと、どちらか一方が切れていないので、切れにくい方で最初に切断して、ゲル抽出して、次の切断をかけてゲル切りだしします。そうすると、切断の難しい方が100%切断できています。 確実な方法だと思います。どちらか一方が切れていないという事をはじめて経験したので、 EcoRVとBamHIという普段使っていない組み合わせが原因の一つだということですかね。 >レスですが、~さんが言われるように、読まないのは不安ですよね。私はとにかく確認することは重要だと思っていますが、切り貼りだけだから読まないっていう方私の周りにも結構いるんですよね（トピ主さんは違う理由でしょうけれども）。 私もpumpkinさんと同じで切り貼りでも読みたい派ですが、うちのボスがPCR以外は読まないという考えです。 EcoRV/SpeIからSmaI/SpeIへのライゲーション試します。

(無題) 削除/引用 No.385-26 - 2009/04/24 (金) 23:02:46 - new+power+generation >Pumpkinさん もちろん根本的な解決でないことはわかっています。 ただ、取りにくいcloneとかもあるので、１日も早く作れと言われているのであれば、多少数をこなしてでも（24とか48とかのPCRなんて作業自体は30分もかかりません）cloningしてしまうことも根本的な解決だと思います。

(無題) 削除/引用 No.385-25 - 2009/04/24 (金) 22:46:04 - qq 私は、こういうとき、EcoRVとBamHIでdouble-digestして、vectorだけでligation/transformします。 コロニーが出るようだと、どちらか一方が切れていないので、切れにくい方で最初に切断して、ゲル抽出して、次の切断をかけてゲル切りだしします。そうすると、切断の難しい方が100%切断できています。 それで、vectorだけでligation/transformすれば、きっとコロニーが出なくなります。（それでもダメなら別の方法を考えますけど）もちろん、この時、別にinsertをligation/transformしますよ。どっちにしても、controlが大切です。

(無題) 削除/引用 No.385-24 - 2009/04/24 (金) 22:17:07 - Pumpkin >誰もコロニーPCRを勧めないのはなぜでしょうか コロニーPCRが根本的な解決になっていないからだと思います。あくまで確率論の問題ですが、カラーセレクションしていながら8個拾ってあたりがないというのは系として効率的でないと思います。ケースバイケースで、全てとはいえませんが。

(無題) 削除/引用 No.385-23 - 2009/04/24 (金) 22:09:53 - new power generation 誰もコロニーPCRを勧めないのはなぜでしょうか。。。 個人的には８個つついて当たりが無いことはよくあるので不思議には思わないですが。 急いでいる時こそ確実に進めるべきだと思います。あわてるとロクなことにならないことが多いのは私だけ？？

(無題) 削除/引用 No.385-22 - 2009/04/24 (金) 16:36:13 - おお >[Re:11] 苦労人さんは書きました : > みなさん、いろいろアドバイスありがとうございます。 > > >はずれのクローンEcoRVやBamHIで切れますか? > > それはやらなかったのですが、EcoRVとBamHIの外側にXhoIとSpeIがあり、 > その酵素で切り出せなかったので、emptyと判断しました。 > emptyと判断 というのはそれで良いと思いますが、空のベクターはEcoRV BamHIのサイトが潰れているのがほとんどだと思います。ですので切れるのであれば、ベクターの切れ残り(一方だけ切れていないとか)があってそれがセルフでライゲーションしたとかそれなりに問題点を探れる情報になり得ます。そうすると次のても取りやすくなりますよね。 SpeI SmaIでしたっけ、、、大丈夫だと思いますよ。取りかかれる複数の方法 を(できれば同時に)やるのはある意味早道です。同じところで どつぼにはまらない可能性をかんがえるといいことだと思います。

(無題) 削除/引用 No.385-21 - 2009/04/24 (金) 16:16:10 - ザンギ シーケンスの出来ない環境でプラスミド構築は結構しんどいですね。 >[Re:11] 苦労人さんは書きました : > >はずれのクローンEcoRVやBamHIで切れますか? > > それはやらなかったのですが、EcoRVとBamHIの外側にXhoIとSpeIがあり、 > その酵素で切り出せなかったので、emptyと判断しました。 > > insertとなる3.5kbのgeneもバックボーンは全く同じpBluescriptで > BamとEcoRVでクリアに切り出せていたので、同時に制限酵素で消化したvector側のpBluescriptもBamとEcoRVで消化できていると判断しましたが、これは問題ないでしょうか？ 切断部位周辺の配列も違うしクローンも違うので、確認したことになって ないと思います。 単純な乗せ換え作業でも、うまくいかないときは厳密にコントロールを とっていかないと解決できないことがあります。 全てのコントロールを厳密にとると膨大な実験量になってしまうので、 僕も端折りがちです。 あれこれ、あてずっぽうでやってると、無駄に時間がかかるだけだと思いますよ。

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