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(無題) 削除/引用 No.385-20 - 2009/04/24 (金) 13:51:45 - Pumpkin >シークエンスができないので、PCRは使わないでLentiのvectorにいれることを考えています。 横レスですが、~さんが言われるように、読まないのは不安ですよね。私はとにかく確認することは重要だと思っていますが、切り貼りだけだから読まないっていう方私の周りにも結構いるんですよね（トピ主さんは違う理由でしょうけれども）。単にサブクローンでも読んでしまうあたり、ちょっとやり過ぎかもしれませんが。この辺りは考え方の違いなのでしょうが。 本題とずれたので無視してください。

(無題) 削除/引用 No.385-19 - 2009/04/24 (金) 13:42:36 - ~ インサートを含むpBSをBam HIとEco RVで切ってblunting→切り出し レンチウイルスベクターも適当な制限酵素で切ってblunting、CIAP処理→切り出し 両社をライゲーション 制限酵素地図であたりが出たら、外注で配列確定 ではだめですかね。 レンチウイルスベクター内にあわせるフレームがないのでしたら、 向きだけの問題だと思いますけど。 >シークエンスができないので、PCRは使わないでLentiのvectorにいれることを考えています。 いくら切り貼りだけだといっても、全く読まずに実験に使うのは不安ではありませんか？

(無題) 削除/引用 No.385-18 - 2009/04/24 (金) 12:55:53 - 苦労人 >ぱんたさん ありがとうございます。 明日SmaI/SpeIを試してみます。

(無題) 削除/引用 No.385-17 - 2009/04/24 (金) 12:54:13 - 苦労人 NotIが使えないのは、最終的にLentiのvectorにいれたいのですが、そこにNotIがないからです。 なので、まわりくどいですが、pBluescriptからpBluescriptのBamHIとEcoRVの間にライゲーションして、insertの両端にXhoIとSpeIを作りたいのですが、それがどうしてもうまくいきません。 シークエンスができないので、PCRは使わないでLentiのvectorにいれることを考えています。

(無題) 削除/引用 No.385-16 - 2009/04/24 (金) 12:51:46 - ぱんた ＞繰り返しになりますが、EcoRV/SpeIからSmaI/SpeIへのライゲーションは普通にできますよね。 できます。

(無題) 削除/引用 No.385-15 - 2009/04/24 (金) 12:47:47 - 苦労人 インサートがNotIに入ってるので、NotIより手前に使える酵素がありません。 唯一ATGの直前のEcoRVのみが使えます。 バックボーンのpBluescriptを回収していることはないとおもうのですが、 もしそうならpBluescriptの中にpBluescriptが入ってるのでしょうか？ pBluescriptのMCSから離れた場所にScaIがあるので、それで分断してから ゲルを切り出すことも考えています。 繰り返しになりますが、EcoRV/SpeIからSmaI/SpeIへのライゲーションは普通にできますよね。

(無題) 削除/引用 No.385-14 - 2009/04/24 (金) 12:35:47 - ぱんた インサートを切り出したとき、バックボーンのpBluescriptを回収していたとか。。。まさか無いですよね？ 状況がよくわかっていないんですが、pBluescript→pBluescriptなら、別の粘着末端2つを用いることはできないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.385-13 - 2009/04/24 (金) 12:05:24 - 苦労人 >通りがかり 確かに私も最初それを疑いました。 目的の産物の内部に三カ所のSacIがあるのですが、 SacIでも3kbのシングルバンドなんですよ。

(無題) 削除/引用 No.385-12 - 2009/04/24 (金) 11:54:01 - 通りがかり 単にインサートとベクターのバンドが重なっていたというオチではないでしょうね

(無題) 削除/引用 No.385-11 - 2009/04/24 (金) 11:47:02 - 苦労人 みなさん、いろいろアドバイスありがとうございます。 >はずれのクローンEcoRVやBamHIで切れますか? それはやらなかったのですが、EcoRVとBamHIの外側にXhoIとSpeIがあり、 その酵素で切り出せなかったので、emptyと判断しました。 insertとなる3.5kbのgeneもバックボーンは全く同じpBluescriptで BamとEcoRVでクリアに切り出せていたので、同時に制限酵素で消化したvector側のpBluescriptもBamとEcoRVで消化できていると判断しましたが、これは問題ないでしょうか？ Quigenのキットでゲルを生成した後に、ライゲーションしました。 それと、いまたまたま別の方法を思いついてたのですが、 EcoRV(平滑)とSpeIで切り出したインサートを SmaI(平滑)とSpeIで消化した別のベクターにライゲーションするというのは、一般的な方法ですか？ もしそれが簡単な方法なら、one step少なくて済みます。 基本的な質問で恐縮ですが、一日も早くコンストラクトを作れと命令されております。 どなたかアドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.385-10 - 2009/04/24 (金) 10:57:46 - AP 変異が入っていなくて、ちゃんと切れる配列があったとしても、cloning siteの二重消化は近接しすぎていて電気泳動像では区別できないので、片方しか切れていない可能性はあります。横着をして至適バッファーの違う酵素で同時に切ろうとすると、その可能性はかなり高くなります。丁寧に順次消化するに限ります（経験的にはBamHIはH buffで全く問題ないので、Hなら同時消化okだと思いますが）。 二重消化の場合でも、コロニーは出るけれどカラばっかりというときは、片側しか切れていない可能性があり、これには（多少、ligation効率が落ちるとも）脱リン酸処理でS/Nを高めるのが有効です。

(無題) 削除/引用 No.385-9 - 2009/04/24 (金) 10:32:36 - ザンギ 文章を端折りすぎで意味不明ですね。 変異が入って切れないプラスミドが混ざってると、2種類の酵素で切ったつもりでも、1か所でしか切れてない奴が相当数混ざってるのでライゲーション後にセルフのクローンが出てくるという意味です。 >[Re:7] ザンギさんは書きました : > クローニングサイトに時々変異が入って制限酵素で切れなくなることがあります。 > そういうのがベクターに数％でも混ざってるとセルフライゲーションしたのがコロニーに出てくるので苦労することがあります。 僕も2重消化ではBAPはしません。 変異プラスミドが原因の場合には本質的な解決にはならないですね。

(無題) 削除/引用 No.385-8 - 2009/04/24 (金) 10:16:40 - あべちゃん BamH1サイトはCIAPやBAPをしっかりと処理してしまうと、りライげーションの効率が著しく悪くなるような印象を私は持っています。 個人的には、セルフライげーションしない制限酵素の組み合わせの場合、CIAPなどはしないです。ただ、これは一般的ではないと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.385-7 - 2009/04/24 (金) 09:34:13 - ザンギ クローニングサイトに時々変異が入って制限酵素で切れなくなることがあります。 そういうのがベクターに数％でも混ざってるとセルフライゲーションしたのがコロニーに出てくるので苦労することがあります。 おおさんの指摘を全部クリアすれば解決するとおもいますけど、参考まで

(無題) 削除/引用 No.385-6 - 2009/04/24 (金) 09:18:15 - おお >[Re:1] 苦労人さんは書きました : > 平滑末端と粘着末端という組み合わせはよくないのでしょうか？ 一般論として悪い組み合わせではありません。 > それとももう少したくさんのクローンを拾ったほうがよいのでしょうか？ これは意見が分かれるかもしれませんが、ふだん8-9割入る系で 全然取れてこないとするならば、さらにクローンを拾っても 望み薄です(ただ比較できる系なのか分かりませんけど)。 力仕事でやって退ける人もいますが、全体を 見直した方がいいと思います。 フラグメントをどのようにえたか、制限酵素処理後どのように 精製したとか実験にかんして細かいことが示されてないので、 コメントしにくいですが、過去ログで嫌というほど議論されていますので そちらを参照されると良いと思います。 若干注意するところを一応書いておきます。 はずれのクローンEcoRVやBamHIで切れますか? インサートなしでライゲーション+、ライゲーション- などでどの程度のコロニー数が得られますか? それはインサートありのライゲーションに比べて少ないですか? コンピテントは十分な活性がありますか? UVの照射(長波長でも)をさけてますか? > それ以外のユニークな酵素がないので、どうすればいいのか悩んでいます。どなたか詳しい人のアドバイスを期待しています。 どうしても相性が悪いなと思った時に思い切って平滑末端(クレーノーなどでブラントにして)にすると平滑末端の効率は悪いはずですがうまく行ったということもあります。

(無題) 削除/引用 No.385-5 - 2009/04/24 (金) 08:55:01 - CJ 過去ログにもあったと思いますが、平滑粘着の組み合わせが悪いってことはないんじゃないですか？私もつい先日インサートをpBluescriptIIにHindIII/EcoRVの組み合わせを使って突っ込む、という実験を５つほどやりましたが、特に困難はなかったですよ。ただし私の場合はサイズは１ｋｂでしたが。 平滑同士だとセルフライゲーションのことを考えなければならなくなり、面倒な事態を生みそうです。 ただ私はなんちゃってモレキュラー実験しかできないので、歴戦の勇者の皆様の意見も聞きたいところですが。

(無題) 削除/引用 No.385-4 - 2009/04/24 (金) 08:49:17 - DSC 8個のハズレはどのようなクローンだったのでしょうか？ �@もし元のベクターのインタクトな状態が取れてきているのであれば、 �Aさらに、完成したプラスミドにEcoRV siteが存在しない予定ならば、 Ligationの反応溶液に微量のEcoRVを加えておくと有効かも。 個人的にそういう方法が好きで、よくやっています。

(無題) 削除/引用 No.385-3 - 2009/04/24 (金) 05:37:31 - 苦労人 アドバイスありがとうございます。 平滑と粘着の組み合わせより、平滑同士のほうが効率いいのでしょうか？

ライゲーション 削除/引用 No.385-2 - 2009/04/24 (金) 05:28:33 - ? kleknow かT4 polymeraseで平滑にそろえたらどうですか？

EcoRV/BamHIライゲーション 削除/引用 No.385-1 - 2009/04/24 (金) 04:20:09 - 苦労人 pBluescriptのEcoRV/BamHIに3kb程度のあるインサートをライゲーションしたのですが、 8個のクローンを拾ってミニプレップしたのですが、ポジティブなクローンが全くありませんでした。 平滑末端と粘着末端という組み合わせはよくないのでしょうか？ それとももう少したくさんのクローンを拾ったほうがよいのでしょうか？ 普段、粘着末端同士のライゲーションだと9割近くポジティブなクローンです。 それ以外のユニークな酵素がないので、どうすればいいのか悩んでいます。どなたか詳しい人のアドバイスを期待しています。

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