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(無題) 削除/引用 No.3519-7 - 2010/11/18 (木) 12:41:07 - mom-a >ΔΔCT法が無理なら定量的な評価はできず、電気泳動してバンドある・なしで評価するしかないのか？ということが確認したかったのです。 �刧僂t法が無理ということではないと思います。 発現のない組織サンプルはキャリブレーターとしては使用できないというだけではないでしょうか。 私はいつも検量線を入れるので（�刧僂t法は使わないので）、一般的にどうなのかよくわかりませんが、理論的にはキャリブレーターに使うサンプルは目的遺伝子が発現してさえいれば何を選んでも構わないと思いますが…。

回答ありがとうございます！ 削除/引用 No.3519-6 - 2010/11/18 (木) 09:06:32 - 初心者です dcさん、real-timeさん、mom-aさん 書き込みありがとうございます。いろいろ勉強になりました！ PCRにつかっている機械（アプライドバイオシステムズ7500リアルタイムPCRシステム）用のソフト上で、PCR反応が終わってから結果のデータの解析をするとサンプルごとにCT値を計算してくれるのですが、そのCT値が「undetermined」となりました。 みなさんのご回答から、CT値がundeterminedになった理由としてプライマーの問題以外に �@そもそも正常組織に遺伝子が発現していない（或いはとても少ない） �A鋳型cDNA量が少ない（実際20倍希釈でやっていたので、次回希釈率を下げてみます） �Bサイクル数が少ない �C非特異的産物が出てしまっている などが考えられると分かりました。ありがとうございました。 一度PCR産物を泳動してみます。あと、鋳型DNAの量を増やして検討してみます。 > あぁ、�刧僂t法で評価できないなら、PCRでバンドのある・なしで評価すべきか、ということをおっしゃりたかったのでしょうか。 mom-aさん、まさにそのとおりです。ΔΔCT法が無理なら定量的な評価はできず、電気泳動してバンドある・なしで評価するしかないのか？ということが確認したかったのです。一度PCR産物を泳動してバンドをみてみます。ありがとうございます。

失礼。 削除/引用 No.3519-5 - 2010/11/16 (火) 11:52:00 - mom-a ＞＞その場合、この遺伝子の発現については普通にPCRを行い、バンドとして検出するべきですか？ ＞「遺伝子が発現していない」なら、普通にPCRを行ってもバンドは検出できないですよね？ あぁ、�刧僂t法で評価できないなら、PCRでバンドのある・なしで評価すべきか、ということをおっしゃりたかったのでしょうか。 送信してから気がつきました。

(無題) 削除/引用 No.3519-4 - 2010/11/16 (火) 11:49:49 - mom-a ＞CT値が出ずにundeterminedという結果が解析したソフト上で出ました。 ＞この結果の解釈として、プライマーが古くへたってしまっていることも考えられるのですが、 dcさんもおっしゃっているように、これでは何がundeterminedなのかわかりません。読み手には、あなたの使っているソフトがどのような解析をして何を「undetermined」と判定しているのかわからないですから。 私は（おそらくdcさんも）増殖曲線が設定したサイクル数の中で立ち上がらない、すなわち検出限界以下であったということを表示しているのではないかと思ったのですが、real timeさんのおっしゃることを考えると、非特異産物が出てしまってソフトが計算不能に陥っている可能性があるのかもしれません。 （ちなみに、ポジティブコントロールを入れておけば、ポジティブコントロールがきちんと検出できていればプライマーその他試薬は問題ないだろうということが推測できますよね？） ＞その場合、この遺伝子の発現については普通にPCRを行い、バンドとして検出するべきですか？ ＞ΔΔCT法を使って相対的な発現量を求めることはできないということになりますか？？ 「遺伝子が発現していない」なら、普通にPCRを行ってもバンドは検出できないですよね？ 値が0ではキャリブレーターにならないでしょうから、「正常組織」をキャリブレーターにして�刧凾bｔ法を使うことはできないでしょう。 何をどうやっているのか良く分からないのですが、例えばプレート間補正のためのキャリブレーターが必要なのであれば「正常組織」以外をキャリブレーターにすれば良いと思います。 一方、「量が少ないので今回の条件では検出できなかった」のであれば、テンプレートの量を変える、サイクル数を増やすなどの方法で検出可能となれば解決するかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3519-3 - 2010/11/16 (火) 11:20:58 - real-time とりあえず、アガロースでPCR産物を泳動されることをお勧めします。SYBR法で非特異産物が出てしまう状況だと、増幅効率が1を超えたり、鋳型の量とCTの相関性が失われるため、計算不能になる場合があります。 量が少なくて分かりにくいときは、triplicateしたPCR産物を１tubeにまとめ、エタ沈して泳動すれば何かは見えるかもしれません。それでも何も見えないときは鋳型のcDNAの濃度を増やしてみてください。 RT-PCRでは発現量の変化により、プライマーの特異性がぶれますので1回バンドを確認するだけでなく、おかしいなと思ったら頻回に泳動してください。そのうち慣れてくればDenaturation Curveでも反応の特異性が評価できるようになります。

(無題) 削除/引用 No.3519-2 - 2010/11/14 (日) 14:07:17 - dc 使われている機械でundeterminedがどういう時に表示されるのかわかりませんが、増幅曲線が上がって行かないのであれば（増幅していないのであれば）、単に、その遺伝子のトランスクリプトは正常組織には無い（とても少ない）ということではないですか？ もう一度繰り返して同じであれば、ウエスタンやノザンなど別の方法で確認したらどうでしょうか。

リアルタイムPCRの結果の解釈 削除/引用 No.3519-1 - 2010/11/14 (日) 08:03:23 - 初心者です 今回、リアルタイムPCRについて質問させて頂きたく書き込みしました。 まったくの初心者ですので、理解していない点も多く、誤解しているところもあるかもしれませんが、どうぞよろしくお願いします。 今、病変組織と正常組織からRNAを抽出、cDNAを合成してSYBRGREEN法でリアルタイムPCRを行っています。ある遺伝子の発現について、ΔΔCT法を使い、正常組織をキャリブレータとして病変組織での相対的な発現量を調べたところ、病変組織で発現量が上昇していると考えられる結果でした。 同じcDNAを使い、別の遺伝子を調べたところ、正常組織においては、CT値が出ずにundeterminedという結果が解析したソフト上で出ました。 この結果の解釈として、プライマーが古くへたってしまっていることも考えられるのですが、もしプライマーに問題がなかったとして、このUndeterminedという結果は、正常組織においてこの遺伝子が発現していないと考えられるのでしょうか？その場合、この遺伝子の発現については普通にPCRを行い、バンドとして検出するべきですか？ΔΔCT法を使って相対的な発現量を求めることはできないということになりますか？？ 詳しい方、経験のある方いらっしゃいましたら、教えてください。何卒よろしくお願いいたします。

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