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(無題) 削除/引用 No.3644-3 - 2010/12/08 (水) 17:49:51 - yuki 素早い返信ありがとうございます。 塩は3MNaOACを1/10量加えてます。他の実験者がまったく同じ溶液を使ってエタ沈してもきちんと沈殿が採れているので、とりあえず沈殿しやすいように、静置の条件を低温度の長時間にしていますが、他にもっと大きな原因があるのではないかと思うのです。とりあえず、塩は一度新しく作り直してみます。 >DNAがあることを最後に確認したのはどの時点なのでしょうか？ 言葉が足りなくて申し訳ありません。クロロホルム処理後でも確認してましたが電気泳動でDNAははっきり確認できました。 >電気泳動(原液2μlを5倍希釈)で確認しても案の定バンドは出ません。 原液はエタ沈後の産物です。エタ沈後SDW10μlに溶解したもののうちの2μlを5倍希釈して電気泳動したということです。

(無題) 削除/引用 No.3644-2 - 2010/12/08 (水) 17:04:54 - ~ 個人的には、エタ沈時の塩の入れ忘れが怪しいと思っています。 また、 >少なく見積もってもPCI処理の時点 DNAがあることを最後に確認したのはどの時点なのでしょうか？ クロロホルム処理後でDNA量を確認し、それをエタ沈したらDNAが無くなったのであれば、エタ沈が原因でしょうけれども、それより前にしか確認していないのであれば、エタ沈を疑う理由が分かりません。 >電気泳動(原液2μlを5倍希釈)で確認しても案の定バンドは出ません。 原液というのが、どのステップの溶液をさしているのかが分からないのですが。 もとの液という意味ですから、制限酵素処理する前のプラスミド溶液が原液に相当するかと思いますが、多分違いますよね。 AP処理前の話であれば、処理前にバンドが見えないほどDNAが少なければ、 エタ沈しても沈殿は見えないというのは不思議なことでは無いでしょう。 AP処理後、エタ沈前の話であれば、AP処理前にあったDNAが処理後に消えているということで、BAP(に混入したDNase？)によってDNAが分解されたと考えると辻褄が合うと思います。 エタ沈後の話であれば、エタ沈前の時点でのDNA量を確認してはいかがでしょうか。 >10μg/50μlあるものがエタ沈後に操作ミス以外でほとんど無くなってしまうことはあり得ますか？ DNaseが混入すれば、目的のサイズのDNAがなくなることはあり得るでしょう。 >BAPで処理をすると沈殿しにくいなんてことはないですよね・・・？ そのような経験をしたことがありません。

BAPC-75について 削除/引用 No.3644-1 - 2010/12/08 (水) 16:36:40 - yuki 　現在ライゲーションに用いるベクターに対し制限酵素消化、QIAGENのキットで切り出し精製、BAP処理(BAP C-75使用)を行いPCI処理を２度行ってクロロホルムで処理した後、エタ沈を行って精製しているのですが、エタ沈後にまったくと言っていいほど沈殿が生じません。(はじめの遠心前に−30℃で45min静置してます。)電気泳動(原液2μlを5倍希釈)で確認しても案の定バンドは出ません。 　少なく見積もってもPCI処理の時点で10μg/50μlあるものがエタ沈後に操作ミス以外でほとんど無くなってしまうことはあり得ますか？BAPで処理をすると沈殿しにくいなんてことはないですよね・・・？

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