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in vitro 転写反応 トピック削除
No.3943-TOPIC - 2011/02/05 (土) 14:21:01 - SP6
現在、以下のような材料でin vitro転写実験を行っています。
・invitrogen T7 polymerase
・0.5 mM〜2.5 mMまでのNTP
・RNase inhibitor
・5'端にT7 promoter(pETベクターを参考にプライマーを設計)を
もつPCR断片。PCR産物は精製せず、反応液全量の10分の1にあたる
2 uLを使用しています。また、3'側にはORFの後、約1000 bpのベクター配列を
もたせています。
・37度で6時間反応

本条件で、効率よく転写される遺伝子もあるのですが、
極めて薄くしか転写物が得られないケースが多々あります。

Rocheのキットには反応時間が長すぎると収量がおちるとある、との
コメントを過去ログに見つけましたが、その原因がわかりません。

どのようなことでも教えていただければ助かります。
 
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ありがとうございます 解決済み 削除/引用
No.3943-3 - 2011/02/10 (木) 01:05:18 - SP6
とおりすがり様、ご回答ありがとうございます。
なるほど、GGGが良いのですね、クラスIIIのT7プロモーター配列を調べたり
試行錯誤していましたが、大変希望がでてきました。是非、ご指摘の点から実験してみたいと思います。また、試薬についての情報も大変参考になります。購入を検討させて頂きます。
ありがとうございました。

in vitro transcription 削除/引用
No.3943-2 - 2011/02/08 (火) 20:15:56 - とおりすがり
遠い昔、修論のテーマでちょっとだけやったことがあります。
あまり参考にならない気もしますが…。

T7プロモーター直後の配列は何ですか?
GGGからスタートじゃないとものすごく転写効率が落ちます。
あと、Rocheとは間逆ですが
37℃でO/Nでやるとよかったときもありました。

PCR産物は電気泳動でラダーでないことを確認しましたか?

あとは思い切って酵素を変えるとか。
http://www.epibio.com/cellscript.asp
のT7キットは高価ですが効率がとてもよかったです。

あまりお役に立てずすみません。

in vitro 転写反応 削除/引用
No.3943-1 - 2011/02/05 (土) 14:21:01 - SP6
現在、以下のような材料でin vitro転写実験を行っています。
・invitrogen T7 polymerase
・0.5 mM〜2.5 mMまでのNTP
・RNase inhibitor
・5'端にT7 promoter(pETベクターを参考にプライマーを設計)を
もつPCR断片。PCR産物は精製せず、反応液全量の10分の1にあたる
2 uLを使用しています。また、3'側にはORFの後、約1000 bpのベクター配列を
もたせています。
・37度で6時間反応

本条件で、効率よく転写される遺伝子もあるのですが、
極めて薄くしか転写物が得られないケースが多々あります。

Rocheのキットには反応時間が長すぎると収量がおちるとある、との
コメントを過去ログに見つけましたが、その原因がわかりません。

どのようなことでも教えていただければ助かります。

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