いつも勉強させていただいております。
現在トランスフォーメーション後の大腸菌はペレットとしては十分増えるのですがDNA収量がミニプレップ(キアゲン)3mlスケールで10μg/ml程度と低く困っております。色々なスレッドでもこのような問題の解決法が記載されていましたがそれでも解決できなかったので何かご意見を頂けないでしょうか。
形質転換したDNAはquick changeの方法で作成したインサートとベクターのtotal6.5kbp程です。すみませんがどちらも実名を挙げることは控えさせてください。使用している大腸菌はtakaraのHB101です。あるタンパク質のポイントミューテーションを複数作成していて、その中の一部でこのような現象が起きてしまったので、DNA回収に至るまでの操作は問題がないかと思っております。以前は100μg/ml程の収量でした。
行った解決策は
1.AMPの量を4倍加える
AMPは培養の初期段階でなくなってしまい、競合的に耐性を獲得していない菌が増殖する場合があるとのことを伺ったので2倍、４倍と振ってみましたがDNA収量は同様に低いままでした。
2.再形質転換
得られたDNAを再形質転換を行ってシングルコロニーからミニプレップまで行ったのですが同様の結果でした。
3.培養時間の変更
通常は16時間で行っていたのですが24時間、12時間で行ったのですが同様の結果でした。ただ、24時間では培地から硫黄臭がし、酵母などは増えすぎるとそのような気体を出すと記載されていたので、そのせいで液性が変わり、最終のDNA液がN3を加えた段階でトラップできないのかと考えましたが違ったようです。
考えられた原因はコロニーを長期保存しすぎ(３週間)たのでコピー数の減少化と思いましたが再形質転換でも解決できなかったことから違うところに原因があるようです。
実験の本質的な部分がわかっていなく的を得て質問できていないかもしれませんがご意見を頂けると幸いです。つたない文章ですが最後まで目を通していただいてありがとうございます。 |
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