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(無題) 削除/引用 No.1537-44 - 2013/04/06 (土) 16:32:30 - おお よかったですね。フィードバックがいただけたので、有用な情報になりました。

とれました！ 削除/引用 No.1537-43 - 2013/04/04 (木) 18:36:52 - 学生 皆さんのおかげで今日、目的のものが取れました。 シーケンスは確認していませんが、欠失した８０ｂｐの中央部分にのみ含まれる制限酵素で切れたので目的のものだと思います。仮にエラーがあったとしても、あとのポイント変異は自分でなおしていけると思います。 どうやってとったのかというと、 ＡrepairとＢのフラグメントを別々に増幅し、それを別個に精製してテンプレートに。 プライマーなしでＰＣＲ連結のために１０サイクル（おおさんの仰ったようにアニール時間を延ばしました）、後からAf-Brを低濃度で加えてサイクル数を２５回で全長をとりました。 ノンスペが出まくるのでＰＣＲの条件を色々振ってみましたが、Ｔｍ値を高くすれば何とかバンドが出ました。 非常〜〜に苦戦しましたが、皆さんのおかげで克服できて嬉しいです！ 先生方、どうもありがとうございました。 皆さんの全てのアドバイスが役に立ちました、また何かありましたらよろしくお願いいたします。 cDNAクローンを買おうかと思っていたところでしたが、何とかなりました。

(無題) 削除/引用 No.1537-42 - 2013/04/03 (水) 02:33:01 - え このままだとPCRのエラーなのか、欠失したものが発現しているのか区別できないので、cDNAクローンを買った方がいいと思いますよ。普通のcDNAクローンなら高くないのでPCRを繰り返すよりコストがかからないと思うのですが。 難しいときはKOD Xtremeを使ってます。東洋紡のKOD FXに相当するかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1537-41 - 2013/04/03 (水) 02:12:09 - おお 80bほど抜けている産物がいろいろな細胞でメジャーであるというのであれば、そのこと自身も重要なことかもしれませんので、抜けたものもとっておいた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1537-40 - 2013/04/03 (水) 02:08:22 - おお >[Re:34] 学生さんは書きました : > >おお様 > >その80bぬけたものをプラスミドにいれて、そのプラスミドをsite direct mutagenesis するのもてかなぁ。 > どうしてもだめだったらそのキットを買ってもらいます。ただ、恥ずかしながら予算がないもので・・・。 その80bを入れたいところを末端にして、プラスミドごとPCRしてlinearなDNAフラグメントをつくり、80bをオリゴかゲノムからのPCRでふやしライゲーションする。80bのフラグメント末端に燐酸がひつようです。

(無題) 削除/引用 No.1537-39 - 2013/04/02 (火) 10:26:51 - 学生 皆さま、引き続きお世話になっております。 今日、明日ぐらいに目的のものが取れたらいいなと願っています。 >mon様 >Esp3I, BsaI, AarIなどの認識配列と切断部位が異なる酵素を使う方法があります。 ちょっと今のプライマーで上手くいかなければ新しくプライマーをかけ直してやってみようと思います。 >おお様 >AとBの間をつなぐにはそのつなぐ末端の少なくともどちらかに燐酸が必要ですよ。 あああ！やらかしてました。その点についての意識がさっぱりありませんでした。それで全く取れなかったのかもしれません、やり直してみます。 何故クローニングで取れなかったのか分かってすっきりしました、ありがとうございます！ >RNAも複数のソースを当たってみた方がいいかも。組織が違うとスプライシングのパターンも変わりますので。 複数の細胞株の、ランダムプライマーで作成したcDNAから試しました。この部分が抜けるという報告も他にないので、何故こういうことが起こっているのか不思議です。 >80ベースぐらいの配列が1つのエクソンになっているのでしょうか。 はい、エクソン１の終わりぐらいに位置する配列です。 >774様 >A+repairとBのフラグメントのクローニングができて配列の確認ができれば、 これをテンプレートにPCRで繋ぐほうが、cDNAから作るより楽じゃないかと思います。 なるほど、一度クローン化してしまった方がいいということですね。 >TakaraのInfusionで制限酵素を使わずに繋ぐかですかね。 Infusionはあるので、制限酵素がうまくいかなければ試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1537-38 - 2013/04/02 (火) 07:31:40 - 774 >AとBを別個にPCRで増幅した時に（どちらか一方に？）80bpの欠失があるのか？ AとBを別箇で増幅すると、A側に80bpの欠失があります。 A-(repair)-Bというように直したくて、今、(A+repair)とBの二つが用意できています。 >AとBを別個にPCRで増幅したフラグメントはクローニング済みでしょうか？ 今作っているところです。ありがとうございます。 ただ、ＡとＢの間に適切な制限酵素サイトがないので、困っているところです。 A+repairとBのフラグメントのクローニングができて配列の確認ができれば、 これをテンプレートにPCRで繋ぐほうが、cDNAから作るより楽じゃないかと思います。 （ノンスペが減りそうに思います。） これがうまくいけば制限酵素サイトは考慮しなくて済むんですが。 それかTakaraのInfusionで制限酵素を使わずに繋ぐかですかね。

(無題) 削除/引用 No.1537-37 - 2013/04/02 (火) 07:08:22 - おお RNAも複数のソースを当たってみた方がいいかも。組織が違うとスプライシングのパターンも変わりますので。 ESTとかクローニングしたやつは手に入らないんでしょうか。それかその遺伝子のプラスミドを使っている論文をさがして、そこからもらうとか。 ゲノムの配列はどうなってますか?その80ベースぐらいの配列が1つのエクソンになっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1537-36 - 2013/04/02 (火) 04:28:46 - おお >PCRの末端は普通のプライマーだと燐酸かされてませんけどそれはごぞんじですよね。 ベクター側はリン酸化されているものを使っていますが、それでよいでしょうか。 AとBの間をつなぐにはそのつなぐ末端の少なくともどちらかに燐酸が必要ですよ。

mon 削除/引用 No.1537-35 - 2013/04/01 (月) 17:49:22 - mon ＞ＡとＢの間に適切な制限酵素サイトがないので、困っているところです。 Esp3I, BsaI, AarIなどの認識配列と切断部位が異なる酵素を使う方法があります。 これらの酵素認識配列が目的DNA断片になければ「認識配列＋6~10bpほど」をPrimerに含めておきます。 これなら任意の配列で連結できます。

(無題) 削除/引用 No.1537-34 - 2013/04/01 (月) 10:55:40 - 学生 皆さま本当にお世話になっております。 今日も今日とてＰＣＲの条件をふってみようと思います。 >おお様 >その80bぬけたものをプラスミドにいれて、そのプラスミドをsite direct mutagenesis するのもてかなぁ。 どうしてもだめだったらそのキットを買ってもらいます。ただ、恥ずかしながら予算がないもので・・・。 >PCRの末端は普通のプライマーだと燐酸かされてませんけどそれはごぞんじですよね。 ベクター側はリン酸化されているものを使っていますが、それでよいでしょうか。 >ライゲーション後、それを１度PCRで全長増やしたほうが楽かなあとも思いますけど. それもやってみたのですが、全長PCRがかかりませんでした。 >774様 >A-fとB-rで一気にPCRで増幅した時に80bpの欠失があるのか？ そうです。正確に言うと、Ａ領域とＢ領域の中間に欠失ができます。 なので、欠失を修正するために欠失部分を挟んでＡとＢに分けました。 >AとBを別個にPCRで増幅した時に（どちらか一方に？）80bpの欠失があるのか？ AとBを別箇で増幅すると、A側に80bpの欠失があります。 A-(repair)-Bというように直したくて、今、(A+repair)とBの二つが用意できています。 >AとBを別個にPCRで増幅したフラグメントはクローニング済みでしょうか？ 今作っているところです。ありがとうございます。 ただ、ＡとＢの間に適切な制限酵素サイトがないので、困っているところです。 >え様 >GCリッチなど難しいPCRに対応できるPCR酵素とバッファーに変えたら欠失がなくなりました。 Prime Starなので、GCリッチ配列にも対応していると思いますが、条件はもっと検討してみるべきなのかもしれません。もしお勧めの酵素があれば教えていただければ嬉しいです。 >AP様 >80 bp欠けるというのは、比較対象はなんでしょうか。報告されているcDNA配列？ はい、そうです。報告されている配列です。こちらには未知のスプライシングバリアントだと言える確証がないですし、実験の目的はcDNAクローンを取りたいだけなので・・・。 PCRは、この遺伝子に関してはどんなプライマーをかけてもかなりPCRがかかりにくい（ノンスペが出まくる）印象です。

(無題) 削除/引用 No.1537-33 - 2013/03/30 (土) 03:59:17 - え スレッド全部読んでないのですが、テンプレートのcDNAは完全長なのに、PCR産物の中間に欠失ができてしまうというのは経験したことがあります。GCリッチなど難しいPCRに対応できるPCR酵素とバッファーに変えたら欠失がなくなりました。

(無題) 削除/引用 No.1537-32 - 2013/03/29 (金) 17:39:33 - AP >遺伝子の全長を取りたいのですが、cDNAからＡとＢのプライマーでPCRするといつも同じ部分（真ん中です）が８０ｂｐぐらい欠けます。 PCRのエラーでどうしても欠けた産物が出来てしまうというような特殊な配列だとしたら、欠けた配列を補ってoverlap extension PCRをかけても同じことが起こってもとのもくあみじゃないでしょうか。overlap extension PCRでも最終的に全長を増幅するPCRで産物を取得するので。 80 bp欠けるというのは、比較対象はなんでしょうか。報告されているcDNA配列？ ゲノム配列からの予想されたhypothetical RNA? 未知のスプライスバリアントが存在し、80 bp短いのがあって正解ということはないですか。

(無題) 削除/引用 No.1537-31 - 2013/03/29 (金) 17:05:38 - 774 少しわかりづらいので、確認させて下さい。 A-fとB-rで一気にPCRで増幅した時に80bpの欠失があるのか？ AとBを別個にPCRで増幅した時に（どちらか一方に？）80bpの欠失があるのか？ AとBを別個にPCRで増幅したフラグメントはクローニング済みでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1537-30 - 2013/03/29 (金) 16:47:46 - おお >[Re:28] 学生さんは書きました : > 遅くなって申し訳ありません。実はまだ取れないのです。 > あれから、Ａ＋Ｂのフラグメントをライゲーションしてベクターに導入してみましたが、インサートが取れませんでした。 どのようにやったのかわからないのでこのことに関してはアドバイスができませんが、、、 PCRの末端は普通のプライマーだと燐酸かされてませんけどそれはごぞんじですよね。 ライゲーション後、それを１度PCRで全長増やしたほうが楽かなあとも思いますけど.

(無題) 削除/引用 No.1537-29 - 2013/03/29 (金) 16:41:47 - おお その80bぬけたものをプラスミドにいれて、そのプラスミドをsite direct mutagenesis するのもてかなぁ。 http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5990-5152EN.pdf

(無題) 削除/引用 No.1537-28 - 2013/03/29 (金) 16:19:04 - 学生 遅くなって申し訳ありません。実はまだ取れないのです。 あれから、Ａ＋Ｂのフラグメントをライゲーションしてベクターに導入してみましたが、インサートが取れませんでした。 ですのでまたＰＣＲに戻ってきましたが、どうしても目的のサイズより下にＰＣＲ産物が出ます。 ＰＣＲ条件を振ってみましたが、ノンスペがたくさん出ます。 こうなるともう、プライマーの設計がよくないのかもしれません。 どうしてこういうＡ＋Ｂのようなことをしているのかというと、 遺伝子の全長を取りたいのですが、cDNAからＡとＢのプライマーでPCRするといつも同じ部分（真ん中です）が８０ｂｐぐらい欠けます。 なので、その欠けている配列を修正プライマーで補って、それからＡとＢをライゲーションということを考えているのですが、取れません。 皆さんのご意見をもとに、色々と試してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1537-27 - 2013/03/26 (火) 03:48:15 - おお 本人も15ベースでしたっけ、重なっているといってますから、、、

(無題) 削除/引用 No.1537-26 - 2013/03/26 (火) 03:44:43 - うん 私もAPさんの最初のコメントは正しいと思います。 できないのは単に反応の条件が悪いのでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1537-25 - 2013/03/25 (月) 16:17:30 - AP >(2)の意味の対義語は、backやposteriorのはずですから。 加えて、（1)の対義語と共通するbackwardもありえましたね。 forward primerに対してbackward primerという記載がされていたら、どっちがどっちか曖昧になることはありそうです。

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