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(無題) 削除/引用 No.7047-26 - 2018/07/03 (火) 19:01:01 - 新入り >[Re:25] APさんは書きました : > >大腸菌を遠心分離機でペレットダウンしようとする際にも、4度にするよう指示があり、これもそのような意味ですか？ > > 生物試料を扱うとき、必要の無いときは温度を低く保つというのはお約束事。 > 生理反応、酵素反応、死後反応などが進むと悪影響があるから。 > > > っっと、いうか、なんでもかんでも教えてちゃんじゃきりがないよ。 > プラスミド取りにかぎったことじゃなく、分子生物学実験、生化学実験、あるいはひろく一般的な実験の約束事、考え方の理解が足りないのじゃなかろうか。 > > あまり枝葉のことにこだわらずに、根っことなる、なんていうかな実験生物学のフィロソフィーみたいなものを吸収するようにしたらいいんじゃないか？　各種、実験手引き書も参考にして。 >[Re:24] APさんは書きました : > >solution2は常温、 > 氷冷すると析出します。高濃度のNaOHとSDSが共存しているので、ドデシル硫酸がナトリウム塩となって析出しやすくなっている。 >[Re:23] APさんは書きました : > リゾチーム入れてヴォルテックスをかけてもプラスミド精製上は問題ないと思う。言うてもリゾチームだけじゃなかなか溶菌しませんから。大腸菌を溶菌して融合タンパク質なんかとるときだって、リゾチームだけあるいはプラス低張処理くらいじゃ全然効かない。 > > それと、リゾチーム入りのsoln 1で大腸菌ペレットを再懸濁すると言うのはないと思う。第一に酵素なのでsoln 1に希釈された状態では保存性が悪い。 > 第二に、やったことなくて脳内だけだけでこねくり回しるんだと思うけど、大腸菌の沈殿にリゾチームを直接入れてしまうと、表面の大腸菌が溶けて固まって、それ以上懸濁するのが困難になります。まず大腸菌を懸濁してからリゾチームを加えるのが作法。 APさま いろいろと教えていただき本当にありがとうございました。 これからは実験一般に通じるような考え方、お作法、フィロソフィを身に付けるような勉強をして、もう少し自分でいろいろと考えられるように努力します!! 本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7047-25 - 2018/07/03 (火) 16:57:55 - AP >大腸菌を遠心分離機でペレットダウンしようとする際にも、4度にするよう指示があり、これもそのような意味ですか？ 生物試料を扱うとき、必要の無いときは温度を低く保つというのはお約束事。 生理反応、酵素反応、死後反応などが進むと悪影響があるから。 っっと、いうか、なんでもかんでも教えてちゃんじゃきりがないよ。 プラスミド取りにかぎったことじゃなく、分子生物学実験、生化学実験、あるいはひろく一般的な実験の約束事、考え方の理解が足りないのじゃなかろうか。 あまり枝葉のことにこだわらずに、根っことなる、なんていうかな実験生物学のフィロソフィーみたいなものを吸収するようにしたらいいんじゃないか？　各種、実験手引き書も参考にして。

(無題) 削除/引用 No.7047-24 - 2018/07/03 (火) 16:16:36 - AP >solution2は常温、 氷冷すると析出します。高濃度のNaOHとSDSが共存しているので、ドデシル硫酸がナトリウム塩となって析出しやすくなっている。

(無題) 削除/引用 No.7047-23 - 2018/07/03 (火) 12:37:35 - AP リゾチーム入れてヴォルテックスをかけてもプラスミド精製上は問題ないと思う。言うてもリゾチームだけじゃなかなか溶菌しませんから。大腸菌を溶菌して融合タンパク質なんかとるときだって、リゾチームだけあるいはプラス低張処理くらいじゃ全然効かない。 それと、リゾチーム入りのsoln 1で大腸菌ペレットを再懸濁すると言うのはないと思う。第一に酵素なのでsoln 1に希釈された状態では保存性が悪い。 第二に、やったことなくて脳内だけだけでこねくり回しるんだと思うけど、大腸菌の沈殿にリゾチームを直接入れてしまうと、表面の大腸菌が溶けて固まって、それ以上懸濁するのが困難になります。まず大腸菌を懸濁してからリゾチームを加えるのが作法。

(無題) 削除/引用 No.7047-22 - 2018/07/03 (火) 12:20:24 - 新入り >[Re:20] APさんは書きました : > リゾチームを使わない場合、Glusoeは意味がない。 > 入っているとしたら、それは古い方法の遺物か、オプションでリゾチームを使う場合に兼用できるように（たとえば、たぶんMolecular Cloneingのレシピ。miniではリゾチームを使わないが、midi以上では使う。でもSoln 1は共通）。 > > さらに、リゾチームを使う場合でもGlusoeは必須ではない。私も大きいスケールで精製するときはリゾチームを使うことがあるが、Glusoseは入れていない。 > おそらくGlucoseを入れるのは、誰かが書いていたようにスフェロプラストを作るときの方法の名残。プラスミド精製法の開発はむかしの細菌学者なんかがやったんだろうけれど、細菌からモノ取りをするときのお作法として、まずスフェロプラストにすべしという固定観念があったに違いない。 > > ところで「性染色体」ってなんなん？ APさま 少し前のプロトコールから説明して頂いてよくわかりました。 そのリゾチームを用いたプロトコールでも、1液(リゾチーム入り)を加えてvoltexしていたのでしょうか？それで問題はないのでしょうか？ すみません、ふつうにプラスミドとは別に大腸菌が持っている染色体を意味しようとしました。たんに「染色体」と書くべきでした。

(無題) 削除/引用 No.7047-21 - 2018/07/03 (火) 12:17:44 - 新入り >[Re:19] APさんは書きました : > 氷冷30分というのは塩析の過程だと思うが、塩析の効果を高めるには冷やすのだ。 > > 高濃度のSDSを冷やすと析出するでしょ。アルカリSDS法では酢酸カリウムや酢酸アンモニウムを加えて、より析出しやすいドデシル硫酸のカリウム塩、アンモニウム塩にしている。 APさま わかりました！ solution1と3は氷冷しておく、solution2は常温、というのはその塩析に関わるので、収率などを考えての指示だったわけですね。 大腸菌を遠心分離機でペレットダウンしようとする際にも、4度にするよう指示があり、これもそのような意味ですか？

(無題) 削除/引用 No.7047-20 - 2018/07/03 (火) 11:07:48 - AP リゾチームを使わない場合、Glusoeは意味がない。 入っているとしたら、それは古い方法の遺物か、オプションでリゾチームを使う場合に兼用できるように（たとえば、たぶんMolecular Cloneingのレシピ。miniではリゾチームを使わないが、midi以上では使う。でもSoln 1は共通）。 さらに、リゾチームを使う場合でもGlusoeは必須ではない。私も大きいスケールで精製するときはリゾチームを使うことがあるが、Glusoseは入れていない。 おそらくGlucoseを入れるのは、誰かが書いていたようにスフェロプラストを作るときの方法の名残。プラスミド精製法の開発はむかしの細菌学者なんかがやったんだろうけれど、細菌からモノ取りをするときのお作法として、まずスフェロプラストにすべしという固定観念があったに違いない。 ところで「性染色体」ってなんなん？

(無題) 削除/引用 No.7047-19 - 2018/07/03 (火) 08:31:21 - AP 氷冷30分というのは塩析の過程だと思うが、塩析の効果を高めるには冷やすのだ。 高濃度のSDSを冷やすと析出するでしょ。アルカリSDS法では酢酸カリウムや酢酸アンモニウムを加えて、より析出しやすいドデシル硫酸のカリウム塩、アンモニウム塩にしている。

(無題) 削除/引用 No.7047-18 - 2018/07/03 (火) 08:07:23 - 新入り たびたびすみません。 このプロトコールでは所々で氷冷するように書いてあるものも見受けます(氷冷30分以上というものも見つけました)。 酸塩基反応によって放出される熱はこの場合では微々たるものだと思います。 この氷冷は、大腸菌が持っている何らかの酵素活性を抑えるという意味合いでよろしいでしょうか?? どなたかご存知であればまたご教授くださいますと嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.7047-17 - 2018/07/03 (火) 07:56:50 - 新入り >[Re:16] おおさんは書きました : > >グルコースは浸透圧を与えて細胞膜を破壊する役目 > > ここはちょっと気になる表現だけど、低張液で細胞をバーストさせようということなのでグルコースなしでも細胞壊れるよね。 おお様 おはようございます。 仰る通りだと思います。 私はLysozymeとグルコースを含んだ溶液を使ったことがないのでわからないのですが、再懸濁液にこのような溶液を用いてVoltexをかけても問題はないのでしょうか。 細胞骨格によって膜タンパク質に結合している性染色体をSDS変性・カリウムとの複合体形成によって沈澱させて分離すると理解していました。 なので、この再懸濁のタイミングで細胞(壁)を壊すようなことをしてしまうと、染色体DNAまで外側に露出してしまい、膜タンパク質と性染色体との結合が奪われる、性染色体が物理的な力によって断片化する、といった状況になり、最終的にはプラスミドDNAを含んだ溶液に混ざってしまうのではないか、という風に考えて気になっておりました。

(無題) 削除/引用 No.7047-16 - 2018/07/03 (火) 04:42:19 - おお >グルコースは浸透圧を与えて細胞膜を破壊する役目 ここはちょっと気になる表現だけど、低張液で細胞をバーストさせようということなのでグルコースなしでも細胞壊れるよね。

(無題) 削除/引用 No.7047-15 - 2018/07/03 (火) 00:12:15 - 新入り >[Re:11] おおさんは書きました : > 温故知新さんわざわざありがとうございました。 > むかしこのような議論をしたことがあり、実際に其の出典まで確認したのをおぼえてました。ちょっと昔のものを拾うまで手が回りませんでしたけど。 > > バッファー効果ということでその当時は議論していましたが、どうも普通の生化学的なバッファーというと違うような気がしてまして、誤解が生ずるだろうということでOH-イオンの調整という表現に今回いたしました。 >[Re:6] おおさんは書きました : > > ＞Solution1を入れて再懸濁した時点では、大腸菌が破裂したり、細胞膜が溶解・変性しているような状態にはなっていないような気がします。 > > おそらくそうでしょうけど、プロトコールはそれにこだわっているわけではないでしょう。なぜならリゾチームをさらにそれに加えてもいいから、 おお様 温故知新さまの御回答と併せて、とてもすっきり理解できました。 ほんとうにありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7047-14 - 2018/07/03 (火) 00:11:03 - 新入り >[Re:10] APさんは書きました : > グルコース入りのバッファーはすぐカビが生えるので使い勝手が悪い。もしコンタミに気づかず使ってしまったら、、、百害あって一利なしですね。 >[Re:9] APさんは書きました : > 初期のプロトコールでは、いわゆるSoln 1にLysozymeを入れるのが常識でした。Lysozymeで外膜がなくなると、低浸透圧ではその時点で細胞が破裂してしまいます。むしろグルコースは細胞の破裂を防ぐ働きをするはず。それは植物細胞でも、赤血球でも、細菌でも同じ。細胞壁の生成を妨げるペニシリン系の抗生物質で細菌が死ぬのはそのせいです。そのバイオよもやま話とかいうのにそんなことが本当に堂々と書かれていたとすると、なんかこの業界、迷信だらけの未開族のようです。 > > 最近では、少なくともミニプレップ程度ではLysozymeは不必要というのが常識で、それとともにglucoseを加えるレシピはあまり見なくなりました。 APさま ご回答ありがとうございました。Molecular cloningを紐解いてみますとLysozymeのプロトコールも載っていました。 いまさら聞けないプラスミド抽出法の原理 https://www.sbj.or.jp/wp-content/uploads/file/sbj/8909/8909_yomoyama_1.pdf こちらに載っていました。私の誤解ではないと良いのですが。。。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7047-13 - 2018/07/03 (火) 00:08:08 - 新入り >[Re:8] 温故知新さんは書きました : > もういっちょ > > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=4183 >[Re:7] 温故知新さんは書きました : > http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=2153 温故知新さま お調べいただきありがとうございました。大変参考になります。

(無題) 削除/引用 No.7047-12 - 2018/07/02 (月) 23:04:23 - 温故知新 大腸菌をスフェロにするときは20%スクロースを使うので、等張にしようとするならそのくらいは必要なのでは？

(無題) 削除/引用 No.7047-11 - 2018/07/02 (月) 23:02:50 - おお 温故知新さんわざわざありがとうございました。 むかしこのような議論をしたことがあり、実際に其の出典まで確認したのをおぼえてました。ちょっと昔のものを拾うまで手が回りませんでしたけど。 バッファー効果ということでその当時は議論していましたが、どうも普通の生化学的なバッファーというと違うような気がしてまして、誤解が生ずるだろうということでOH-イオンの調整という表現に今回いたしました。

(無題) 削除/引用 No.7047-10 - 2018/07/02 (月) 21:57:35 - AP グルコース入りのバッファーはすぐカビが生えるので使い勝手が悪い。もしコンタミに気づかず使ってしまったら、、、百害あって一利なしですね。

(無題) 削除/引用 No.7047-9 - 2018/07/02 (月) 21:51:02 - AP 初期のプロトコールでは、いわゆるSoln 1にLysozymeを入れるのが常識でした。Lysozymeで外膜がなくなると、低浸透圧ではその時点で細胞が破裂してしまいます。むしろグルコースは細胞の破裂を防ぐ働きをするはず。それは植物細胞でも、赤血球でも、細菌でも同じ。細胞壁の生成を妨げるペニシリン系の抗生物質で細菌が死ぬのはそのせいです。そのバイオよもやま話とかいうのにそんなことが本当に堂々と書かれていたとすると、なんかこの業界、迷信だらけの未開族のようです。 最近では、少なくともミニプレップ程度ではLysozymeは不必要というのが常識で、それとともにglucoseを加えるレシピはあまり見なくなりました。

(無題) 削除/引用 No.7047-8 - 2018/07/02 (月) 21:40:20 - 温故知新 もういっちょ http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=4183

(無題) 削除/引用 No.7047-7 - 2018/07/02 (月) 21:37:09 - 温故知新 http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=1;Code=2153

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