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(無題) 削除/引用 No.7085-57 - 2018/08/17 (金) 18:26:30 - AP どんな検出系でも肝心なのはS/Nです。バックグラウンドノイズが皆無ということはまずないので、陰性のサンプルにある程度シグナルが出るのはしょうがない。それでも、正真正銘の当たりのシグナルが桁違いに高ければいいわけです。 コロニーPCRではインサートを挟む、あるいはインサートとベクターをまたぐプライマーを使えば、このノイズはかなり低くできます。でも、今回疑われるような連結産物からの増幅もあり得るし、他のトピでもちょっと話題になったんですが、overlap extensionで目的のサイズの産物が生じる可能性もある。プライマーの設計だけでは程度の差こそあれ完全には防げない。 でも、そういうのは量的に微量であって、本物の当たりならば鋳型のコピー数が桁違いに多いとなれば、S/Nは十分で見誤ることもないでしょう。 たぶん、CT値で10以上違うんじゃないかな。なので20-25サイクルくらいじゃ、本物の当たりしか見えてこない。

(無題) 削除/引用 No.7085-56 - 2018/08/17 (金) 14:44:45 - LIC おおさん、よく分かりました。 答えまで示してくださりありがとうございます。 私は10年ほどこの業界にいますが、気づきませんでした。バカですね。 今回バンドの強度が強いものをミニカルチャーしています。 かなりの確率で、欲しいものが漸く漸く漸くできることになります。 本当に嬉しいです泣。おおさん、APさん、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.7085-55 - 2018/08/17 (金) 13:24:14 - おお 今回の問題はサイクル数を調整することでかなり回避できると思います。Ligationの仕方にもよるでしょうけど、今回の場合インサートのプライマー部分の外側はLigationされないので、FwもRvもベクターからだと、Ligation productはニックがはいって反対側まで届かないはず。Ligationのストラテジーが違うと通用しないし、インサートが大きいとPCRがかかりにくくなってわけがわからなくなる場合もあるかも。 プレートにまいたLigation productsをなるべく避けるには、コロニーを一度少量LBに移して数時間増殖させて、数マイクロとってPCRするとかいろいろやる人はいますが、、、手間が増えるほどcPCRのメリットがなくなってきます。 まあそんなこんなであまりcPCRは好きでありません。

(無題) 削除/引用 No.7085-54 - 2018/08/17 (金) 12:14:27 - LIC おおさん、APさん、 そういうことか！確かに。。。自分は今まで疑わずよくここまで来れましたね。。。 ではコロニーPCRのプライマーってどうデザインすべきなのか混乱してきました。 私はこれまでこのデザインの仕方でかなりの数のコンストラクトを作ってきました。 あまりにも浅はかですね。なぜ疑問に思わなかったんだろう。。。 考えてみます。気づきをくださってありがとうございます。 もう自分が怖いです。

(無題) 削除/引用 No.7085-53 - 2018/08/17 (金) 11:17:47 - AP ちょっと論旨がわからない。 >その可能性はプライマーのデザインからして考えにくいです。 >なぜならFwdプライマーをPCR産物上に、Revプライマーをベクター上に置いているからです。 でもligationしてるのだから、連結された分子ができるわけでしょう。 かりに大腸菌と混ぜずにライゲーション産物だけプレートにぬっても、プレート上にその分子が隅々まで存在しているのですから。その上に、ハズレのコロニー、逆向きのコロニーがあって、それを突いてPCRをかけると大腸菌の中のプラスミドは鋳型にならないとしても、プレート上の連結分子は鋳型になるはず。それは微量であっても理論的に一分子あれば40サイクルで見えてくる。 わたし、なにか勘違いしてるかしら？

(無題) 削除/引用 No.7085-52 - 2018/08/17 (金) 11:17:09 - おお ＞その可能性はプライマーのデザインからして考えにくいです。 ＞なぜならFwdプライマーをPCR産物上に、Revプライマーをベクター上に置いているからです。 FwdプライマーをPCR産物上に、Revプライマーをベクター上といいますが、Ligationで少なくともFwプライマーから伸びた末端がベクターとつながりRevプライマーの（相補鎖の）とこまでDNA鎖がつながっているので、Revプライマーから伸長してFwまでいきつきますよね。逆はプライマーがリン酸化されていないとつながってないけど。 >確率から考えて、半分は順向きに、残りの半分は逆向きにクローニングされているはずだからです。 >ただ今回、かなり強いバンドが11、弱いバンドが13でした。 Ligation productsを直接PCRしたらかかるだろうし、それがプレートに塗られているから大腸菌に入ってないLigation productsも大腸菌の周りにあるだろうということです。

(無題) 削除/引用 No.7085-51 - 2018/08/17 (金) 10:46:12 - LIC APさん、おおさん、 ｃPCRのサイクル数の問題、仰る通りですね。 疑わず、これまでのプロトロル通りにしていました。 次回からまずサイクル数を減らしてみます。 >一方、13コロニーでその強さの5分の1程度の強さの330ｂｐバンドが不幸にも見られてしまいました。 これって、大腸菌に入っていないライゲーション産物もプレートに塗りたくられているのだから、それを鋳型に増えた可能性があります。コロニーがないところを突いても出るような代物じゃないですか。 その可能性はプライマーのデザインからして考えにくいです。 なぜならFwdプライマーをPCR産物上に、Revプライマーをベクター上に置いているからです。 ただ私もそれを正直疑っています。なぜなら、今回ベクターをSsp1で平滑カット後、そこへPfuで増やしたPCR産物をクローニングしているためです。 確率から考えて、半分は順向きに、残りの半分は逆向きにクローニングされているはずだからです。 ただ今回、かなり強いバンドが11、弱いバンドが13でした。 なので（なのでという接続詞もおかしいですが）11がモノである可能性が高いと考えています。 今、ミニカルチャーで増やしていて、明日、制限酵素カットでものかどうか、シークエンスも含めて検討してみます。 ただ、このプライマーデザインでなぜすべてのコロニーでバンドがでるのかは説明ができませんが...

(無題) 削除/引用 No.7085-50 - 2018/08/17 (金) 10:30:50 - おお >大腸菌に入っていないライゲーション産物もプレートに塗りたくられているのだから、それを鋳型に増えた可能性があります。コロニーがないところを突いても出るような代物じゃないですか。 私もそう思っていたんです。そのうち書こうかとおもってましたが、APさんがフォローしてくれました。

(無題) 削除/引用 No.7085-49 - 2018/08/17 (金) 10:16:05 - AP コロニーPCRで40サイクルは多すぎでしょう。 40サイクルと言うと鋳型1コピーからでも検出できるというくらいです。 コロニーで、しかも多コピーあるプラスミドが鋳型ですからね。 >一方、13コロニーでその強さの5分の1程度の強さの330ｂｐバンドが不幸にも見られてしまいました。 これって、大腸菌に入っていないライゲーション産物もプレートに塗りたくられているのだから、それを鋳型に増えた可能性があります。コロニーがないところを突いても出るような代物じゃないですか。

(無題) 削除/引用 No.7085-48 - 2018/08/17 (金) 05:48:59 - LIC おおさん、ありがとうございます。 いつもcPCRは40サイクル回していますが、多過ぎという感覚なのですね。 以後、25くらいでやることにします。 プライマーはインサート上にフォワードを、ベクター上にリバースを配置し、ライゲーションが起きたものだけをみているはずです。いつもこれで何１００とクローニングをしてきたのでcPCR自体は大丈夫のはずなのですが... 相対的に強いバンドの中で4つだけピックし、今ミニカルチャー中です。。。 これで出来てくれたら本当に嬉しいです... ここからタンパク質発現、精製が始まるので、ただのスタートラインに過ぎないのですが...orz >[Re:47] おおさんは書きました : > 40サイクルもやるといろんなものが見えてきてかえって信用できないと思えるのですが、、、 > ２０サイクルくらいで増えないとなんとも気持ち悪いです。せいぜいプライマーの増幅効率が悪くても２５サイクル程度じゃないかなぁ。。。 > > プライマーはインサートとベクター側にデザインしてLigationが起こったものを見てますか？

(無題) 削除/引用 No.7085-47 - 2018/08/17 (金) 05:14:35 - おお 40サイクルもやるといろんなものが見えてきてかえって信用できないと思えるのですが、、、 ２０サイクルくらいで増えないとなんとも気持ち悪いです。せいぜいプライマーの増幅効率が悪くても２５サイクル程度じゃないかなぁ。。。 プライマーはインサートとベクター側にデザインしてLigationが起こったものを見てますか？

(無題) 削除/引用 No.7085-46 - 2018/08/17 (金) 04:14:38 - LIC cPCRを24コロニーかけ、40サイクル後の電気泳動の結果、11コロニーで強い予想される330ｂｐバンドがでました。 一方、13コロニーでその強さの5分の1程度の強さの330ｂｐバンドが不幸にも見られてしまいました。 後者の原因は不明ですが、今急いで前者のコロニーを4つピックし、ミニカルチャーを行いました。 これがモノであればもう嬉しすぎる... 一方エンプティプラスミドの形質転換した残りを、カナマイシンをすでに含むLBプレートに撒きました。 これでもしモノが出てこれば、カナマイシンを表面上に塗る操作は少なくともこの場合は不適切と思われます。 どうか、コンストラクションうまくいきますように。。。

(無題) 削除/引用 No.7085-45 - 2018/08/17 (金) 00:55:44 - LIC APさん、おおさん、ありがとうございます。 実は今日衝撃的なことがわかりました。 midiprepしたものをおおさんのご支持通り再度DH5alphaに形質転換したところ、まったく生えませんでした。ただこの時、plainのプレートにカナマイシンを塗る操作をしました。 一方、昨日Pfuで増やしたPCR産物がラストわずかに残っていたので、そのままSsp1処理したベクターに入れ、ライゲースを友人から新しいものを分注してもらい、5時間オンアイス後、カラム精製、再度Ssp1処理して、新しいDH5alpha（隣のラボからのもらいもの）に形質転換したところ、たくさん500個ほど？コロニーが生えていました。。これからｃPCRを行うところです。 以上のことから、原因はどこか未だにわかりませんが、 ライゲースがへたっていた。 自作のDH5alphaがへたっていた。 LBプレートにカナマイシンを塗りたくるのは不適切かもしれない。 以上のことを考えています...これからｃPCRで陽性のものが採れたらもうすべてが報われます。。 T4ポリメラーゼの使い方に関してもアドバイスいただき、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.7085-44 - 2018/08/17 (金) 00:43:53 - おお T4 Pol処理、室温３０分って書いてますね。 私は平滑末端をつくるのに室温でやってたようなきがします。１０分ぐらいにしてました。On Iceからチューブを室温に移すので実際は室温より低い温度だったかもしれません（Water bathなど使ってませんので）。その後はすぐにフェノールクロロフォルムを入れて即座にボルテックスしてましたね。 まあ室温というときは２５度であると考えると研究室の室温がどれくらい管理されているかも考慮がいるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7085-43 - 2018/08/16 (木) 21:48:13 - AP T4 polは過剰量のdNTP入れて平滑化に使いますが、これが案外難しい。 平滑を通り過ぎて陥没してしまってうまくいかないことがあります。 コツは、反応温度を12℃程度に下げること。T4 polは伸長活性に対してexo活性が高く、温度を下げることで釣り合いが取れるといいます(see Molecular Cloning)。 また不活性化に高温処理は失敗の元です。不活性化する前に削れ込みが起こる可能性が高い。フェノールぶっ込んで抽出するとかカラム精製するのが無難。 過剰なdNTP存在下でその塩基まで削って付着末端を作る戦略のようですが、InFusionではそんな面倒くさいことしなくてもうまくことになってますけどね。

(無題) 削除/引用 No.7085-42 - 2018/08/16 (木) 10:11:32 - LIC 今回使用しているのはDH5αという株で、私自身が約半年ほど前に自作したものです。 これまでコンピテンシーを気にしたことはありませんでしたが、欲しいものは採れてはいました。 ただ、最近-80℃冷凍庫のドアを開けっ放しにする人もいたりするので、へたってきたのかもしれませんね。 おおさんありがとうございます。コントロールは今後も置いていきます。 APさん、 はい、熱ショック後の回復培養は37℃、1時間行っています。

(無題) 削除/引用 No.7085-41 - 2018/08/16 (木) 07:53:21 - AP カナマイシンプレートに塗布する前に回復培養は十分にしていますか。 37℃で1時間くらい。

(無題) 削除/引用 No.7085-40 - 2018/08/16 (木) 07:19:37 - おお >ただコントロールをこれでもか、ととっていて良かったです。 特に系が働かないときどこに原因があるか見極めるのに有効で基本です。系がはたらいている、いないにかかわらずコントロールを完璧に取っていれば対応を速くすることが可能ですが、それは現実の作業の中でどうするかは研究者それぞれ違いますので、ご自身でよく考えながら作業するといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.7085-39 - 2018/08/16 (木) 07:15:18 - おお >2.　Ssp1処理したプラスミドをゲル抽して、その一部に水とライゲースを加えてセルフライゲーションを起こさせた後、再度、Ssp1処理したサンプル >2.　期待としては0 実際制限酵素で切ってしまったベクターでも弱いながらTransformation活性があります。ベクターインサートの切り貼り作業では、直鎖化したベクターでも１０個ぐらいのコロニーがでるくらいのコンピテンシーがあるコンピテントセルを使うように心がけるべきです。１個でもコロニーができるくらいであればまあ使える範囲内かなと思えばいいかと思います。 一応確認ですがBL21などB株系のコンピとか使ってないですよね。

(無題) 削除/引用 No.7085-38 - 2018/08/16 (木) 07:14:08 - LIC ライゲースを使って今日も一部のクローニングに成功しています。大丈夫のはずなのですが... 今日新しく培地にカナマイシンを加えたLBプレートを作りましたので、トラフォを試してみます。 コンピは隣のラボからコマーシャルのものを貰う予定です。 まさかこんなことになるとは...時間がもったいないですね。 ただコントロールをこれでもか、ととっていて良かったです。 ありがとうございます。

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